JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:48 min. • April 30th, 2023
- Zacznij od wzięcia uśpionej myszy i zabezpiecz ją taśmą laboratoryjną na desce do sekcji. Użyj nożyczek, aby rozciąć skórę. Wykonaj pionowe nacięcie przez przeponę i przetnij żebra, aby dotrzeć do klatki piersiowej, odsłaniając serce i płuca. Następnie wykonaj małe nacięcie w lewej komorze serca. Następnie zlokalizuj prawą komorę i włóż strzykawkę zawierającą PBS do światła komory. Wykonaj PBS przez prawą komorę, pozwalając krwi wypłynąć z wcześniej przygotowanego nacięcia w lewej komorze, aż płuca staną się białe. Wyjmij tkankę płucną zawierającą guzki nowotworowe i zmiel na małe kawałki.
Inkubować kawałki w buforze do wytrawiania płuc. Kolagenaza w buforze trawienia płuc pomaga izolować komórki, a DNAza pomaga eliminować DNA z martwych komórek. Odcedź powstałą zawiesinę przez sitko do komórek, aby usunąć grudki i ujednolicić zawiesinę komórek. Odwirować i ponownie zawiesić osad w buforze chlorku amonu i potasu w celu lizy pozostałych erytrocytów. Wirować w celu zebrania WBC i komórek nowotworowych w osadzie. Zawiesić osad w PBS uzupełnionym FCS, aby utrzymać stabilność komórki. W poniższym protokole zademonstrujemy przygotowanie zawiesiny komórek płuc do analizy cytometrii przepływowej.
Po osiągnięciu odpowiedniego punktu końcowego doświadczalnego należy namoczyć tuszę w 70% etanolu i przymocować zwierzę do deski rozbiorowej. Wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej i delikatnie odwróć skórę, aby odsłonić mięśnie ściany klatki piersiowej i narządy jamy brzusznej. Za pomocą nożyczek przebij przeponę i przetnij żebra odsłaniające klatkę piersiową. Wytnij mały otwór w lewej komorze i użyj igły o rozmiarze 27, aby trzykrotnie przebić płuco przez prawą komorę za pomocą 6 do 8 mililitrów lodowatego PBS na infuzję. Po ostatniej perfuzji płuca powinny być całkowicie wolne od krwi i wydawać się białe. Po zbiorach użyj nożyczek, aby zmielić tkankę płucną na małe kawałki.
Przenieść fragmenty płuc do 2-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 1,5 mililitra buforu do wytrawiania płuc na 30 do 60 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Pod koniec trawienia przenieś zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 mikronów do probówki o pojemności 50 mililitrów i użyj końca sterylnego tłoka strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby przecisnąć pozostałe fragmenty tkanek przez filtr. Przepłukać sitko 15 mililitrami PBS uzupełnionymi 2% FCS i zebrać komórki przez odwirowanie. Zawiesić osad w 1 mililitrze buforu do lizy chlorku amonu potasu na 5 minut inkubacji w temperaturze pokojowej i ponownie odwirować komórki. Następnie ponownie zawiesić osad białych krwinek w 1 mililitrze PBS uzupełnionym 2% FCS i wybarwić komórki do analizy cytometrii przepływowej zgodnie z protokołem eksperymentalnym.