JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:39 min. • April 30th, 2023
- Na początek pobierz próbki guza płuc jako próbki tkanek lub jako próbki cytologiczne z płukania oskrzeli - płukania solą fizjologiczną zawierającą komórki z wnętrza dróg oddechowych. Aby przygotować próbki tkanek, przenieś świeżo wypreparowaną tkankę płucną do kasety do zatapiania. Utrwal i zakonserwuj tkankę za pomocą formaliny o odpowiednim stężeniu.
Aby przygotować próbki cytologiczne, najpierw potraktuj płyny do płukania oskrzeli DL-ditiotreitolem w celu homogenizacji. Odwirować i usunąć supernatant. Następnie potraktuj roztworem mukolitycznym w celu upłynnienia śluzu i oddzielenia komórek. Odwirować w celu granulacji komórek i utrwalenia ich formaliną. Potraktuj komórki odpowiednim odczynnikiem do przygotowania bloków komórkowych, aby zagęścić próbkę podczas pracy z małymi objętościami granulek.
Przenieś granulat do kasety do zatapiania. Przetwarzać oba rodzaje próbek, odwadniając je za pomocą serii stopniowanych kąpieli alkoholowych. Usunąć alkohol za pomocą odpowiedniego środka czyszczącego, a następnie naciekać woskowinę. Zanurz kasetę w płynnym wosku parafinowym i pozwól mu zastygnąć. Tworzy to warstwę wokół tkanki, utrzymując próbkę na miejscu.
Użyj mikrotomu, aby uzyskać cienko pokrojone kawałki. Umieść sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych, aby ułatwić przyczepność. Wysuszyć i zabarwić, aby obserwować szkiełka pod mikroskopem. W poniższym protokole demonstrujemy techniki przygotowania próbek z tkanki nowotworowej płuc i próbek cytologicznych.
Na początek umocuj tkankę nowotworową w 10% neutralnej buforowanej formalinie w kasecie i zanurz kasetę w parafinie, jak opisano w protokole tekstowym. Osadź przesączaną tkankę w formie wypełnionej stopioną parafiną. Pozostaw chusteczki w formie, aż parafina stwardnieje. Następnie za pomocą mikrotomu należy przeciąć tkankę zatopioną w parafinie o grubości trzech mikrometrów.
Przenieś taśmę parafinową na dodatnio naładowane szklane szkiełko mikroskopowe. Następnie suszyć szkiełko przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Najpierw zbierz popłuczyny oskrzelowe w roztworze konserwującym. Przenieś popłuczyny do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj dwa gramy DL-ditiotreitolu i wiruj probówkę przez 30 minut. Następnie odwirować 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Usuń supernatant i dodaj 10 mililitrów roztworu mukolitycznego. Wstrząsać próbką ze średnią prędkością przez 20 minut i odwirowywać przy 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant i umieścić osad komórkowy w probówce zbiorczej zawierającej 10% neutralnej buforowanej formaliny.
Dodać cztery krople środka do przygotowania bloków komórkowych. Przenieś osad komórkowy do kasety. Utrwalić osad komórkowy do zatapiania i cięcia parafiny przy użyciu procesu opisanego wcześniej dla przygotowania próbek tkanki nowotworowej.