JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:32 min. • April 30th, 2023
- Weź funkcjonalizowany drut z małą złotą porcją pokrytą hydrożelem sprzężonym z interesującymi przeciwciałami. Zanurz złotą część drutu w fiolce zawierającej komórki nowotworowe. Zamknij go drucianym korkiem i inkubuj w rotatorze rurowym. Krążące komórki nowotworowe lub CTC wykazujące antygeny powierzchniowe wiążą się z przeciwciałami na drucie. Przepłukać drut, zanurzając go w fiolkach zawierających sól fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS i wysuszyć na powietrzu. Teraz zanurz drut w roztworze acetonu, aby utrwalić komórki poprzez ich odwodnienie.
Następnie delikatnie przełóż drut przez końcówkę P200 z funkcjonalizowaną częścią w środku. Wypełnij taśmę przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem, aby zanurzyć drut. Te znakowane przeciwciała zwiążą się z odpowiednimi antygenami obecnymi na komórkach. Uszczelnij otwór folią laboratoryjną i inkubuj przez noc w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie umyj drut PBS, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Umieść drut w uchwycie drutu i view pod mikroskopem fluorescencyjnym. CTC związane przez przeciwciała fluoryzują na przewodzie. W poniższym protokole uchwycimy CTC na przewodzie medycznym i zidentyfikujemy je za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.
- Aby rozpocząć eksperyment, ponownie zawiesić całą zawartość kolby T75, która jest w 80% zbieżności, w 5-mililitrowej fiolce przy użyciu 4 mililitrów kompletnego podłoża. Następnie wyjmij drut ze szklanego opakowania. Zanurz funkcjonalną złotą część drutu w fiolce, upewniając się, że druciany korek jest wodoszczelnie dopasowany do 5-mililitrowej fiolki. Uszczelnij drut folią laboratoryjną. Następnie inkubuj drut w rotatorze probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po obróceniu przepłucz drut trzy razy w jednym złożonym roztworze PBS, używając trzech różnych czystych fiolek i poczekaj, aż drut wyschnie.
Po wysuszeniu drutu na powietrzu przez 10 minut w okapie, zamocuj ogniwa, zanurzając drut w 100% roztworze acetonu w 5-mililitrowej probówce na 10 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że na funkcjonalizowanej końcówce nie ma śladu acetonu. Suszyć drut na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie w 5-mililitrowej tubie umyj drut dwa razy w jednym składanym PBS. Inkubować drut w buforze do rozcieńczania przeciwciał.
Przygotować 150 mikrolitrów mieszaniny przeciwciał z rozcieńczeniem pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z fluorochromem i buforem do rozcieńczania przeciwciał, jak określono w karcie katalogowej. Następnie użyj końcówki P200, aby wyciągnąć drut z korka drutu i delikatnie włóż drut przez większy otwór końcówki. Najpierw włóż niefunkcjonalny koniec i powoli przeciągnij drut przez mniejszy otwór, aż złota część znajdzie się tuż za większym otworem. Delikatnie dodaj 150 mikrolitrów mieszanki przeciwciał do końcówki.
Aby uniknąć ryzyka tworzenia się pęcherzyków, delikatnie obracaj drut, aż funkcjonalny koniec zostanie całkowicie zanurzony. Uszczelnij otwór końcówki i owiń wokół niego folię laboratoryjną. Inkubuj drut pionowo przez noc w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Drugiego dnia zablokuj inkubację przeciwciał, przemywając drut dwukrotnie w jednym krotnym PBS. Włóż drut ponownie do korka drutu.