Why does centrifugation temperature matter for plasma miRNA isolation?

Centrifugation at 4 degrees Celsius prevents cellular lysis and non-specific miRNA release from blood cells, preserving sample integrity for biomarker analysis.

How does proteinase K protect miRNA during extraction?

Proteinase K degrades proteins, including nucleases, that could otherwise digest RNA during downstream processing, ensuring miRNA stability.

What is the purpose of DNase 1 treatment in the protocol?

DNase 1 removes genomic DNA contamination from the sample, improving the specificity of miRNA purification for downstream applications.

Why must plasma be processed within one hour of collection?

Timely processing prevents ex vivo cellular changes and miRNA release or degradation, maintaining the fidelity of the circulating biomarker profile.

What storage condition preserves extracted miRNA integrity?

Storing the eluted miRNA at minus 80 degrees Celsius prevents RNA degradation and ensures suitability for longitudinal biomarker studies.

Ekstrakcja miRNA: metoda ekstrakcji miRNA z próbki osocza

JoVE Encyclopedia of Experiments

Badania nad rakiem

0 wyświetleń • 3:59 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- MikroRNA lub miRNA to małe niekodujące RNA biorące udział w regulacji genów. Ich ekspresja ulega zmianie podczas raka, a zatem są potencjalnymi biomarkerami raka. Aby rozpocząć izolację miRNA, weź świeżo pobraną próbkę krwi pełnej i odwiruj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby oddzielić osocze od komórek krwi. Przenieść supernatant do świeżej probówki i ponownie odwirować, aby uzyskać bardziej klarowny supernatant osocza. Ekstrahować supernatant, potraktować schłodzonym roztworem homogenizacyjnym, a następnie użyć buforu do lizy w celu homogenizacji próbki. Dodaj roztwór enzymu proteinazy K, aby rozbić białka, szczególnie nukleazy, które w przeciwnym razie trawiłyby RNA podczas dalszych etapów.

- Następnie załaduj lizat do wyznaczonej studzienki wstępnie zmontowanego wkładu do ekstrakcji kwasów nukleinowych specyficznego dla danego instrumentu. Dodaj roztwór DNazy 1 do odpowiedniego dołka, aby wyeliminować genomowe DNA z próbki. Dodaj wodę wolną od nukleaz do probówki elucyjnej umieszczonej na kartridżu w celu kondycjonowania przed izolacją miRNA. Załaduj zespół wkładu do ekstraktora kwasów nukleinowych. Wybierz i uruchom odpowiednie oprogramowanie do oczyszczania miRNA. Po zakończeniu wyjmij probówkę elucyjną zawierającą miRNA i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

- W poniższym protokole pokazujemy ekstrakcję miRNA z próbek krwi pacjenta do badań przesiewowych w kierunku raka płuc.

- Aby rozpocząć ten protokół, użyj probówek próżniowych, aby pobrać 10 mililitrów próbki krwi pełnej. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

- Nie przechowuj krwi pełnej w niskiej temperaturze, np. 4 stopnie Celsjusza, aby uniknąć szoku termicznego i lizy komórek, które prowadzą do niespecyficznego uwalniania mikroRNA.

- Odwiruj osocze w ciągu godziny, aby je oddzielić. Upewniając się, że nie ma kontaktu z pierścieniem limfocytowym, przenieś supernatant do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwirować supernatant w tych samych warunkach. Porcjować 1 mililitr tego supernatantu plazmy do 1,5 milimetrowych kriowialiów, uważając, aby uniknąć zbierania frakcji osocza z dna probówki. Aby rozpocząć izolację RNA, dodaj 200 mikrolitrów wstępnie schłodzonego roztworu OMG do 200 mikrolitrów osocza dla każdej próbki. Aby zapewnić pełną homogenizację, wirować przez 15 do 30 sekund. Aby homogenizować próbkę, dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy i 25 mikrolitrów proteinazy K na próbkę i wiruj przez 20 sekund.

- Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomikserze przez 15 minut. Następnie wybierz metodę tkankową RSC miRNA i załaduj wkład dla każdej próbki na tacę pokładową automatycznego ekstraktora kwasów nukleinowych, odpowiednio umieszczając tłok. Przenieść lizat i dodać 5 mikrolitrów roztworu DNazy 1 do odpowiednich pozycji we wkładzie instrumentu. Do podstawy każdej probówki elucyjnej dodaj 60 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Aby rozpocząć automatyczne oczyszczanie, rozpocznij bieg. Przechowuj wszystkie próbki RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.