Test fototoksyczności in vitro: metoda oparta na PDT do oceny potencjału fototoksycznego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc

- Terapia fotodynamiczna lub PDT to rodzaj terapii światłem wykorzystującej fotouczulacze - cząsteczki aktywowane przez światła o określonych długościach fal. Wzbudzony fotosensybilizator przekształca tlen cząsteczkowy obecny w komórkach w reaktywne formy tlenu, które powodują śmierć komórki. Aby rozpocząć test, należy przygotować pożądany system dostarczania leku oparty na nanocząstkach, przenoszący odpowiednie stężenie fotouczulacza, samodzielnie lub w połączeniu z badanym lekiem.

Dodaj preferowane stężenie tej zawiesiny nanocząstek do hodowli komórek raka płuc. Inkubuj kulturę w ciemności przez odpowiedni czas, aby ułatwić komórkowy wychwyt nanocząstek. Zastąp zawiesinę żądaną pożywką hodowlaną. Następnie umieść laser światłowodowy do terapii fotodynamicznej nad kulturą w optymalnej odległości, ułatwiając równomierne oświetlenie. Naświetlić komórki odpowiednią długością fali przez żądany czas i inkubować przez noc.

Zastąp pożywkę odpowiednim roztworem do pomiaru cytotoksyczności. Użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć żywotność komórek i określić ilościowo efekty cytotoksyczne eksperymentalnego leczenia. Napromieniowane komórki zawierające fotouczulacz wykazują zmniejszoną żywotność. W poniższym protokole przeprowadzimy analizę fototoksyczności in vitro hipokreliny B, fotouczulacza i paklitakselu, leku przeciwnowotworowego, zamkniętego w nanocząstkach kwasu hialuronowego i ceramidu w komórkach raka płuc A549.

- Na początek zsyntetyzuj kwas hialuronowy-ceramid zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Oczyść produkt za pomocą membrany dializacyjnej o mocy 3,5 kilodaltonu i liofilizuj go.

Następnie należy samodzielnie przygotować nanocząstki kwasu hialuronowego-ceramidu, nanocząstki kwasu hialuronowego-ceramidu wraz z fotouczulaczem oraz nanocząstki kwas hialuronowy-ceramid ze środkiem przeciwnowotworowym i fotouczulaczem.

Zasiać linię komórkową raka płuc A549 w studzienkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej o gęstości 1 razy 10 do piątej komórki na dołek i inkubować komórki przez 24 godziny. Następnego dnia usuń pożywkę i umyj komórki 1 mililitrem PBS.

Następnie rozpuść przygotowane nanocząstki w PBS do końcowego stężenia 2 mikromoli na mililitr fotouczulacza, hipokreleliny B, poprzez wirowanie.

Do czterech studzienek dodać 1 mililitr PBS, 1 mililitr pustych nanocząstek kwasu hialuronowego i ceramidu, 1 mililitr nanocząstek zawierających fotosensybilizator i 1 mililitr nanocząstek zawierających zarówno fotosensybilizator, jak i lek przeciwnowotworowy.

Po zakończeniu przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny w ciemności, aby umożliwić wchłonięcie nanocząstek do komórek. Następnie usuń wszystkie roztwory i umyj komórki, dodając 1 mililitr zimnego PBS.

Powtórz etap mycia jeszcze raz, a następnie dodaj świeżą pożywkę hodowlaną. Następnie umieść 24-dołkową płytkę hodowlaną pod włóknem do terapii fotodynamicznej i umieść włókno w odległości 1 centymetra od pierwszego dołka.

- Odległość od włókna terapii fotodynamicznej do komórek była krytycznym czynnikiem w tym badaniu. Ważne było ustalenie optymalnej odległości, która może objąć światłem całą komórkę.

- Następnie załóż okulary ochronne i zgaś światła. Oświetlaj komórki laserem w ciemności przez 5 do 40 sekund, aby aktywować wysoce reaktywny tlen singletowy i inne wolne rodniki w nanocząstkach zawierających fotouczulacz

.

Po ekspozycji na światło inkubuj komórki w ciemności przez 24 godziny. Następnie odessać pożywkę hodowlaną i umyć komórki 1 mililitrem zimnego PBS. Powtórz etap płukania jeszcze raz, a następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki i 10 mikrolitrów roztworu do pomiaru cytotoksyczności do każdej studzienki.

Inkubować komórki w roztworze przez dwie godziny w ciemności, a następnie przenieść wszystkie próbki na 96-dołkową płytkę. Zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.