JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:21 min • April 30th, 2023
- Egzosomy to małe, połączone błoną pęcherzyki przenoszące biomolekuły, takie jak lipidy, białka, DNA, mRNA i mikroRNA. Egzosomy są uwalniane przez różne typy komórek do przestrzeni pozakomórkowych i mogą być izolowane z płynów biologicznych, takich jak osocze.
Na początek odwiruj próbkę osocza, aby usunąć komórki i zanieczyszczenia. Przenieść supernatant osocza do świeżej probówki. Potraktuj osocze pożądanym stężeniem enzymu rybonukleazy. Inkubować próbkę w bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez odpowiedni czas.
Enzym degraduje wszelkie wolne RNA w próbce, podczas gdy egzosomalny RNA pozostaje chroniony. Rozcieńczyć próbkę za pomocą PBS. Następnie dodać żądane stężenie roztworu enzymu proteinazy K i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez odpowiedni czas. Proteinaza K rozkłada większość białek osocza. Dezaktywuje również wcześniej dodany enzym rybonukleazę, eliminując w ten sposób ryzyko degradacji egzosomalnego RNA podczas dalszego przetwarzania.
Dodaj odpowiednią objętość buforu wytrącania egzosomów, aby ułatwić oddzielenie egzosomów od osocza. Odwirować próbkę, aby uzyskać osad zawierający nienaruszone egzosomy. Wyizolowane egzosomy znajdują zastosowanie w dalszych etapach, takich jak ekstrakcja RNA i białek.
W poniższym protokole przeprowadzimy izolację egzosomu z próbki osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca.
- Na początek rozmrozić 1 mililitrową próbkę osocza na lodzie. Po rozmrożeniu kilkakrotnie odwróć probówkę, aby zdezagregować wszelkie krioprecypitaty, które mogły się utworzyć. Następnie odwiruj osocze o sile 2000 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć komórki i zanieczyszczenia. Zebrać supernatant i ponownie odwirować osocze, tym razem przy stężeniu 10 000 G przez 20 minut. Ponownie zbierz supernatant osocza i dodaj 10 mikrolitrów RNAzy. Inkubuj plazmę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w podgrzewaczu bloku termicznego.
- Dodaliśmy etap leczenia RNAzą do standardowego protokołu zestawu w celu degradacji wolnych mikroRNA. Później wykorzystano etap leczenia proteinazą K, zawarty w protokole zestawu, w celu degradacji RNAzy i ochrony integralności egzosomalnych mikroRNA.
- Następnie przenieś plazmę do nowej probówki o objętości połowy objętości 1x PBS i zawiruj ją. Następnie dodać 0,05 objętości roztworu proteinazy K, ponownie zawirować próbkę i inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Teraz dodaj 0,2 objętości buforu wytrącania egzosomów i wymieszaj próbkę przez inwersję. Następnie inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po inkubacji w zimnej temperaturze odwirować próbkę o stężeniu 10 000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pobrać od 20 do 50 mikrolitrów porcji supernatantu i przechowywać ją do celów kontrolnych. Następnie odessać i wyrzucić pozostały supernatant.
Ponownie zawiesić osad egzosomu w wybranym buforze, w objętości zależnej od dalszej analizy. Do analizy RNA dodaj specyficzny bufor do lizy do ekstrakcji RNA.
Niniejszy artykuł omawia izolację egzosomów z próbek osocza, konkretnie od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca. Egzosomy to małe pęcherzyki przenoszące różnorodne biomolekuły, które odgrywają istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej.
Niezawodna izolacja egzosomów z osocza umożliwia nieinwazyjny dostęp do biomarkerów molekularnych, wspierając wczesne wykrywanie i monitorowanie podłużne w badaniach onkologicznych. Ten schemat postępowania zwiększa pewność prognostyczną w odkrywaniu biomarkerów i badaniach translacyjnych poprzez zachowanie integralności RNA i białek egzosomalnych. Metoda ta pozycjonuje płynną biopsję opartą na egzosomach jako skalowalne narzędzie do walidacji biomarkerów w całym portfolio oraz śledzenia progresji choroby.
Niniejszy protokół izolacji egzosomów łączy biologię odkrywczą z badaniami translacyjnymi, wspierając procesy od wczesnej identyfikacji biomarkerów po walidację przedkliniczną.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026