JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:17 min. • April 30th, 2023
- Najpierw umieść plasterek tkanki na bibule filtracyjnej nasączonej PBS, aby zapobiec kurczeniu się komórek lub pęcznieniu poprzez zrównoważenie osmolarności. Przenieś tkankę do kasety histo. Zamknij i umieść kasetę w neutralnym buforowanym roztworze formaliny NBF. NBF zawiera formaldehyd, który wiąże się z grupami aminowymi aminokwasów i zapobiega tworzeniu się kwasu mrówkowego, który pigmentuje tkankę. Pozostaw kasetę na noc w niskiej temperaturze, która zapobiega degradacji kwasów nukleinowych i utrwala tkankę. Odwodnić tkankę wielokrotnymi przemycikami alkoholu.
Umieść go w płynnej parafinie i dociśnij do dna formy. Usuń ciężarek i umieść spód kasety histo na chusteczce. Wlej płynną parafinę na zespół. Poczekaj, aż zestaw zastygnie na zimnej płycie. Parafina jest nierozpuszczalna w wodzie, a po dostaniu się do odwodnionej tkanki twardnieje i pomaga w krojeniu. Przenieś blok tkankowy na mikrotom. Wytnij i zbierz cienkie odcinki tkanki na szkiełku. Jeśli przekrój jest zbyt gruby, tlen i inne składniki odżywcze nie mogą dyfundować w poprzek plasterka, tworząc fałszywy gradient martwicy. Jeśli sekcja jest zbyt cienka, ma tendencję do zwijania się. Film z protokołem bada ekspresję biomarkerów i żywotność komórek z tkanek FFPE raka płuc.
- Aby rozpocząć utrwalanie żądanego plasterka, ostrożnie przenieś go za pomocą kleszczy na 10-centymetrową płytkę zawierającą nasączoną bibułę filtracyjną wypełnioną 2 do 3 mililitrami PBS i pozwól mu unosić się na wodzie. Następnie wyjmij bibułę filtracyjną za pomocą kleszczyków i umieść ją w kasecie histo. Przenieś bibułę filtracyjną do kasety histo. Dodaj kroplę rozcieńczonej hematoksyliny na wierzch wycinka tkanki, aby zaznaczyć pozycję wycinka dla kolejnych kroków. Zamknij kasetę i przenieś ją do 4% neutralnego buforowanego roztworu formaliny i pozostaw na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po umyciu i przetworzeniu kasety zgodnie z opisem w protokole, otwórz kasetę histo i za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij zamocowany plaster z bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną i przenieś plasterek do formy zawierającej ciekłą parafinę.
Użyj płaskiego ciężarka, aby docisnąć tkankę do dna formy do zatapiania, aby zapewnić równomierne cięcie. Umieść dolną część kasety histo na wierzchu formy, dodaj na nią płynną parafinę i pozwól foremce ostygnąć na zimnym talerzu przez 30 minut. Następnie oddziel schłodzoną formę od bloku parafinowego. Za pomocą mikrotomu przygotuj cienkie na 4 mikrometry odcinki bloków tkanek FFPE. Odetnij nadmiar parafiny otaczającej tkankę. Aby uzyskać równe przekroje w całej tkance, wyreguluj kąt bloku tak, aby powierzchnia bloku była zorientowana poziomo w stosunku do ostrza. Za pomocą cienkiej szczoteczki zbierz sekwencyjne skrawki tkanki zatopionej w parafinie, zaczynając od górnej części szkiełek podstawowych. Kontynuuj zbieranie odcinków głębszych warstw tkanek do środka, a następnie dolnej części szkiełek
podstawowych.- Zbieranie skrawków z różnych warstw każdego wycinka tkanki do szkiełek obiektowych odbywa się w celu umożliwienia uchwycenia potencjalnych gradientów indukowanych kulturą w żywotności, migracji komórek lub ekspresji biomarkerów.
- Po zebraniu odcinków należy przystąpić do ich obróbki i dalszej analizy zgodnie z opisem w protokole.