Name: Sondowanie stabilnych izotopów DNA (DNA-SIP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Poznaj metodę sondowania stabilnych izotopów DNA do identyfikacji aktywnych mikroorganizmów bez konieczności ich hodowli. Technika ta pozwala badać metabolizm drobnoustrojów w środowisku naturalnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty w ramach Projektu Strategicznego oraz granty Discovery przyznane J.D.N. przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Właściwe zaprojektowanie eksperymentów z wykorzystaniem analizy znakowania stabilnymi izotopami (SIP) ma krytyczne znaczenie dla uzyskania znakowanego DNA powyżej poziomu tła nieznakowanej społeczności. Kwestie związane z czasem inkubacji próbek, stężeniami substratów, warunkami inkubacji (np. składnikami odżywczymi, wilgotnością gleby), zjawiskiem cross-feedingu oraz powtórzeniami zostały omówione w innych opracowaniach 10,18, dlatego zalecamy czytelnikom zapoznanie się z tymi publikacjami podczas projektowan...

<table><tbody><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, cz.d.a.</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>Bro מקid etylowy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>Liniowa poliakrylanamid</td><td>Odczynnik</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 6000</td><td>Odczynnik</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu w granulkach</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader</td><td>Urządzenie</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Urządzenie</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Urządzenie</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna</td><td>Urządzenie</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>Numer modelu: BSP&lt;br/&gt;Szczegóły zamówienia dostępne na stronie &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt;.</td></tr><tr><td>Zgrzewarka do probówek</td><td>Urządzenie</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Urządzenie</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor do ultrawirówki</td><td>Urządzenie</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła ultrafioletowego</td><td>Urządzenie</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>Wystarczy dowolne źródło UV</td></tr><tr><td>Przyłbica ochronna UV</td><td>Urządzenie</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>Zatworki z gumy butylowej, szare</td><td>Materiał</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirowania</td><td>Materiał</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>Igła hipodermiczna, 23 G, długość 2&amp;#8221;</td><td>Materiał</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówki, 1,5 mL</td><td>Materiał</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki z otworem centralnym, średnica 20 mm</td><td>Materiał</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura, szklane</td><td>Materiał</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>Kapturki do pipet</td><td>Materiał</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>Numer katalogowy dotyczy kapturków 200 &amp;#x03BC;l. Kapturki 10 lub 20 &amp;#x03BC;l można nabyć u tego samego dostawcy</td></tr><tr><td>Przewód pompy, otwór 1,5 mm x ścianka 1,5 mm</td><td>Materiał</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką, 15 mL</td><td>Materiał</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do surowicy, objętość 125 mL</td><td>Materiał</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 60 mL</td><td>Materiał</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza stabilnych izotopów w dna (dna-sip)

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

Sondowanie stabilnymi izotopami DNA (DNA-SIP) jest potężną techniką służącą do identyfikacji aktywnych mikroorganizmów, które asymilują określone substraty węglowe i składniki odżywcze do biomasy komórkowej. Jako taka, ta niezależna od hodowli technika stanowi ważną metodologię przypisywania funkcji metabolicznych zróżnicowanym społecznościom zamieszkującym szeroki zakres środowisk lądowych i wodnych. Po inkubacji próbki środowiskowej ze związkami znakowanymi stabilnymi izotopami, wyekstrahowany kwas nukleinowy poddawany jest ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, a następnie frakcjonowaniu gradientu w celu oddzielenia kwasów nukleinowych o różnych gęstościach. Oczyszczanie DNA z chlorku cezu pozwala na odzyskanie DNA znakowanego i nieznakowanego do późniejszej charakterystyki molekularnej (np. fingerprintingu, mikromacierzy, bibliotek klonów, metagenomiki). Niniejszy protokół wideo JoVE zapewnia wizualne, krokowe wyjaśnienia procedury ultrawirowania w gradiencie gęstości, frakcjonowania gradientu i odzyskiwania znakowanego DNA. Protokół zawiera również przykładowe dane SIP oraz podkreśla ważne wskazówki i ostrzeżenia, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić pomyślną analizę DNA-SIP.

Metoda znakowania stabilnymi izotopami DNA (DNA stable-isotope probing) jest metodą niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji i charakterystyki aktywnych społeczności mikroorganizmów zdolnych do wykorzystania określonych substratów. Asymilacja substratu wzbogaconego w ciężki izotop prowadzi do wbudowania znakowanych atomów w biomasę mikrobiologiczną. Ultracentryfugacja w gradiencie gęstości pozwala na odzyskanie znakowanego DNA do dalszych analiz molekularnych.

Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP) to potężna technika służąca do identyfikacji aktywnych mikroorganizmów, które asymilują konkretne substraty węglowe i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odzyskanie DNA z aktywnych mikroorganizmów, które skonsumowały wybrany substrat wzrostowy, bez konieczności wcześniejszej hodowli laboratoryjnej. Osiąga się to poprzez inkubację próbki środowiskowej z substratem znakowanym stabilnym izotopem w warunkach zbliżonych do tych występujących w naturalnym środowisku. Drugim krokiem procedury jest ekstrakcja całkowitego DNA z tej próbki znakowanej izotopowo.Trzecim krokiem procedury jest poddanie tego DNA ultrawirowaniu w gradiencie gęstości chlorku cezu. Ostatnim etapem procedury jest frakcjonowanie gradientu gęstości w celu uzyskania ciężkiego i lekkiego DNA do późniejszej charakterystyki molekularnej. Ostatecznie, za pomocą różnych dostępnych technik molekularnych, w tym fingerprintingu, mikromacierzy, hybrydyzacji, analizy klonów, bibliotek oraz metagenomiki, można uzyskać wyniki ujawniające tożsamość aktywnych, lecz nieuprawianych w kulturach mikroorganizmów uczestniczących w metabolizmie konkretnego substratu.Witajcie, jestem Josh Neufeld z Katedry Biologii na Uniwersytecie Waterloo. Jestem Eric Dunford, doktorant w laboratorium Neufelda. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę sondowania izotopowego DNA, czyli DNA-SIP, która stała się powszechnie stosowaną techniką łączącą tożsamość nieznanych i potencjalnie niehodowlanych mikroorganizmów z ich zdolnością do wykorzystywania interesującego nas podłoża wzrostowego.Stosujemy tę procedurę w laboratorium Newfelda do badania metabolizmu źródeł węgla w różnych środowiskach lądowych i wodnych. Dzisiaj zaprezentujemy zastosowanie konkretnego substratu węglowego, glukozy 13 C, do próbki gleby. Należy jednak zaznaczyć, że od czasu opracowania tej metody przez grupę Colina Merle'a na Uniwersytecie w Warwick, badacze zdywersyfikowali ten protokół, aby można go było stosować w różnych środowiskach oraz z wykorzystaniem różnych izotopów znakowanych, takich jak azot i tlen.Dzisiaj skupimy się na węglu, jednak sam protokół można zastosować w różnych schematach doświadczalnych. Zatem zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować wszystkie odczynniki do analizy DNA-SIP (DNA stable isotope probing) lub DNA CYP, zgodnie z opisem zawartym w części pisemnej niniejszego protokołu.DNAC rozpoczyna się od inkubacji próbki. Warunki inkubacji różnią się w zależności od wielu charakterystyk próbek i podłoży. Po empirycznym ustaleniu odpowiednich warunków inkubacji, należy dodać właściwą poprawkę podłoża do próbki środowiskowej.Można również zdecydować o dodaniu dodatkowych składników odżywczych w celu umożliwienia wzrostu mikroorganizmów, jeśli jest to wymagane na podstawie inkubacji testowych. Po przygotowaniu inkubacji próbki, należy zakręcić i uszczelnić naczynie, a następnie inkubować próbki środowiskowe zawierające znakowane podłoże. Przedstawiony przykład obejmuje dodanie roztworu glukozy znakowanej węglem 13 do próbki gleby.Następnie należy przygotować inkubację kontrolną, która posłuży jako punkt odniesienia do potwierdzenia widocznego znakowania kwasów nukleinowych zaobserwowanego w kolejnych etapach. Próbkę tę należy przygotować w identycznych warunkach, z wyjątkiem zastosowania nieznakowanego węgla jako podłoża; próbkę środowiskową z nieznakowanym podłożem należy szczelnie zamknąć i inkubować w tych samych warunkach. Po inkubacji należy wyekstrahować DNA z mikrokosmosów, stosując protokół ekstrakcji odpowiedni dla planowanych dalszych zastosowań. Następnie należy określić ilość wyekstrahowanego DNA do kolejnych etapów ultrawirowania, wykorzystując żel agarozowy oraz spektrofotometr.Do ultracentryfugacji należy używać rotorów pionowych lub niemal pionowych, aby zapewnić maksymalną możliwą separację lekkiego i ciężkiego DNA. Rotor Beckman Coulter VTI 65.2 posiada 16 otworów na polimerowe probówki z szybkim uszczelnieniem o pojemności 5,1 mililitra do przygotowania próbek do ultracentryfugacji. W pierwszej kolejności należy obliczyć objętość wyekstrahowanego DNA wymaganą do dodania od 0,5 do 5 mikrogramów DNA do probówek do ultracentryfugacji.Wykorzystując wcześniej określone stężenia DNA. Następnie należy oznaczyć dokładną gęstość roztworu zapasowego chlorku cezu za pomocą cyfrowego refraktometru. Zgodnie z sugestią w protokole pisemnym, należy obliczyć objętość roztworu DNA w buforze gradientowym wymaganą do uzyskania odpowiedniego stosunku mieszania.Wykorzystując te obliczenia, połącz wyekstrahowane DNA z buforem gradientowym i 4,8 mililitrów chlorku cezu w sterylnym jednorazowym probówce o pojemności 15 mililitrów. Otrzymana objętość będzie większa niż określona pojemność probówek do wirówki, aby całkowicie je wypełnić. Na koniec wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 10 razy zgodnie z wariantami tego protokołu.Aby umożliwić wizualizację DNA w probówce, w roztworze gradientu należy zastosować barwnik fluorescencyjny, taki jak bromek etydyny. Zmiana gęstości DNA podczas przygotowania go z czystą kulturą DNA, w tym zastosowanie gradientu bromku etydyny, jak pokazano tutaj, jest szczególnie przydatna do natychmiastowego wizualnego potwierdzenia utworzenia gradientu po każdym wirowaniu. Kroki procedury z zastosowaniem tego podejścia zostały opisane w protokole pisemnym.Aby przygotować ultrawirowarkę, należy najpierw użyć gruszki i pipety Pasteura, aby ostrożnie napełnić probówki do ultrawirowania roztworami gradientowymi. Probówki należy opisać na ich ramionach za pomocą cienkiego pisaka permanentnego. Należy upewnić się, że probówki są napełnione dokładnie do podstawy szyjki, ponieważ niedopełnione probówki mają tendencję do pękania podczas ultrawirowania.Po napełnieniu wszystkich wymaganych probówek roztworami próbek należy zapisać dokładną masę każdej z nich, a następnie posortować probówki w pary o najbardziej zbliżonej masie i dodawać lub usuwać niewielkie ilości roztworu, aż różnica między nimi nie przekroczy 10 mg. Należy utrzymywać poziom roztworu jak najbliżej podstawy probówki. Następnie probówki należy zamknąć za pomocą zatyczek zgodnie z instrukcją producenta.Sprawdzić, czy probówki są szczelnie zamknięte, odwracając je i wywierając umiarkowany nacisk. Ponownie zważyć probówki, aby upewnić się, że po zamknięciu są nadal zrównoważone przed ultrawirowaniem. Dokładnie sprawdzić każde gniazdo rotora, aby upewnić się, że są czyste i wolne od kurzu oraz zanieczyszczeń, które mogłyby przebić probówki podczas ultrawirowania.Włóż probówki do rotora, umieszczając zrównoważone pary naprzeciw siebie. Zapisz położenie każdej próbki w rotorze, ponieważ proces ultrawirowania może sprawić, że etykiety z oznaczeniami staną się nieczytelne. Ostrożnie uszczelnij otwory rotora zgodnie z instrukcjami producenta.Po uszczelnieniu otworów wirnika, umieść go w ultrawirówce. Zamknij pokrywę ultrawirówki i wytwórz próżnię dla wirnika VTI 65.2. Ustaw prędkość obrotową na 44 100 RPM, temperaturę na 20 °C, a czas ultrawirowania na od 36 do 40 godzin.Upewnij się, że pompa próżniowa jest włączona, wybierz maksymalne przyspieszenie i wyłącz hamulec, aby zapobiec zaburzeniu gradientu przez decelerację. Bezpośrednio po ultracentryfugacji ostrożnie wyjmij wirnik. Należy uważać, aby nie przechylić ani nie uderzyć wirnika, aby uniknąć naruszenia gradientów w probówkach.Na koniec delikatnie wyjmij probówki do frakcjonowania gradientowego. DNA można wyekstrahować z probówek do ultrawirówki, stosując technikę frakcjonowania. Aby rozpocząć, napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 60 milliliter sterylną wodą destylowaną i dejonizowaną zawierającą odpowiednią ilość barwnika propofol blue.Aby uzyskać ciemnoniebieski kolor, należy umieścić strzykawkę na ramieniu ładującym pompy strzykawkowej. Następnie podłączyć przewody pompy z dopasowaną igłą 23G o długości jednego cala i włączyć pompę, aż woda zacznie wypływać z końcówki igły. Należy unikać pęcherzyków powietrza w dopływie wody, ponieważ będą one negatywnie wpływać na proces frakcjonowania.Dla każdej próbki przygotuj 12 sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra z etykietami wskazującymi numer próbki i frakcję. Następnie, szybkim i kontrolowanym ruchem przymocuj jedną z probówek do wirowania w ultacentryfudze do statywu z zaciskiem. Przebij dno probówki wzdłuż jej szwu, używając nowej igły 23 gauge o długości jednej cala, a następnie obróć igłę, aby upewnić się, że powstał otwór o jednolitym kształcie.Można zauważyć, że rękawiczki lateksowe zapewniają lepszy chwyt trzpienia igły niż rękawiczki nitrylowe. Używając igły przymocowanej do drenu pompy, w sposób szybki i kontrolowany przebij górną część rurki na górnym ramieniu rurki wzdłuż szwu. Należy zaznaczyć, że można również najpierw przebić górną, a następnie dolną część rurki.Należy również zauważyć, że niewielka ilość oleju mineralnego pokrywającego bark probówki może pomóc zapobiec wyciekom wynikającym z nieprawidłowego uszczelnienia wokół górnej igły przy wcześniej skalibrowanej prędkości pompowania. Pompuj barwioną wodę do górnej części probówki, aby uzyskać 12 frakcji po 425 µl w ciągu 12 minut. Użyj stopera, aby zebrać roztwór gradientowy do oznakowanych probówek do mikrowirówki.Na koniec sprawdź gęstość wszystkich frakcji dla co najmniej jednej próbki lub gradientu kontrolnego, używając cyfrowego refraktometru. Oczekiwane wartości powinny mieścić się w przedziale od 1,690 do 1,760 g/mL, z gęstością średnią wynoszącą około 1,725 g/mL, aby wytrącić DNA ze wszystkich frakcji.Najpierw należy dodać 20 µg liniowej poliakryloamidu jako nośnika do precypitacji i wymieszać poprzez odwracanie probówek. Następnie dodaje się dwie objętości roztworu PEG i ponownie miesza przez odwracanie. Probówki pozostawia się w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby po inkubacji DNA uległo precypitacji.Umieść próbki w mikrocentryfodze, orientując probówki w tym samym kierunku, aby zapewnić spójną lokalizację osadu po wirowaniu. Wirowano probówki przy 13 000 G przez 30 minut; po wirowaniu wyjęto próbki z mikrocentryfogi, a następnie ostrożnie odessano i usunięto nadsącz. Osad powinien być na tym etapie widoczny przy użyciu jasnego źródła światła.Po odwirowaniu osadu wypłucz go 500 µL 70% etanolu. Próbki odwiruj przy 13 000 G przez 10 minut, a następnie ostrożnie odessaj i usuń supernatant. Osad będzie teraz bardziej widoczny, ale będzie się łatwiej oddzielać od ścianki probówki.Pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po wyschnięciu osadów zawieś każdy z nich w 50 µL buforu TE. Na koniec nałóż 5 µL każdej frakcji na żel agarozowy, aby scharakteryzować frakcje gradientu, stosując metody omówione w protokole pisemnym.Typowe wyniki DNA SIP wykażą rozdzielenie znakowanego i nieznakowanego DNA w gradiencie za pomocą ultrawirowania. W idealnym przypadku nastąpi całkowita rozdzielność wysokocząsteczkowego materiału genetycznego, takiego jak ten znakowany węglem 13 i azotem 15, od materiału nieznakowanego; w szczególności pojawią się unikalne profile PCR powiązane z frakcjami od czwartej do ósmej w próbkach inkubowanych z izotopami stabilnymi, których nie będzie w próbkach z substratem naturalnym. Kontrole inkubowane dostarczają silnych dowodów łączących konkretne organizmy z metabolizmem danego znakowanego substratu; gdy badanie przeprowadzono na DNA z dwóch kultur czystych – znakowanego węglem 13 szczepu Methylococcus capsulatus bath oraz nieznakowanego S. methylotrophicus ATCC 1021 – znakowane i nieznakowane DNA genomowe rozdzieliły się do odpowiednich frakcji gradientu o różnych gęstościach.W tym przykładzie DNA znakowane ciężkimi izotopami można zaobserwować w frakcjach od czwartej do piątej, natomiast DNA nieznakowane występuje w wysokich stężeniach w frakcjach od dziewiątej do dziesiątej. DNA z tych samych frakcji, powielone metodą PCR, poddano denaturującej elektroforezie w żelu gradientowym (DGGE), co pozwoliło uzyskać wyraźne wzory prążków odpowiadające dwóm organizmom zawartym w gradiencie. Gęstość frakcji mieści się w zakresie od około 1,580 do 1,759 g/ml i są one przedstawione w kolejności malejącej gęstości od lewej do prawej.Z drugiej strony, rozdzielenie izotopów oraz inkubacje próbek środowiskowych mogą być trudniejsze do interpretacji. Gleby tundry z Resolute Bay w Kanadzie inkubowano przez 14 dni w temperaturze 15 °C z glukozą znakowaną węglem 12 lub węglem 13. Obrazy AeroGel oczyszczonej frakcji DNA z gradientu wykazały rozmazany obraz genomowego DNA w frakcjach od 7 do 10 dla inkubacji zarówno z węglem 12, jak i węglem 13.Jednakże, gdy zastosowano DGGE genów 16 s rRNA w celu określenia wzbogacenia biomasy w węgiel 13 dla konkretnych taksonów mikrobiologicznych, DNA z gleby inkubowanej z glukozą z węglem 12 wygenerowało podobne wzorce we wszystkich frakcjach gradientu, podczas gdy próbka inkubowana z glukozą z węglem 13 wygenerowała profile DGGE jednoznacznie powiązane z frakcjami od piątej do ósmej; zachowane prążki wskazane strzałkami reprezentowały dominujący filotyp spójny we wszystkich frakcjach gradientu. Filotyp przesuwa się w stronę cięższych frakcji dla DNA uzyskanego z gleby inkubowanej z glukozą z węglem 13. Tożsamość tego konkretnego genu 16 s rRNA może zostać określona, aby ukierunkować późniejsze podejścia metagenomiczne lub oparte na hodowli.Właśnie przedstawiliśmy sposób przeprowadzenia eksperymentu stabilnego znakowania izotopowego DNA (DNA stable isotope probing), od inkubacji próbek po uzyskanie znakowanego DNA do analizy molekularnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest uważne zaplanowanie przebiegu doświadczenia oraz dbałość o to, aby nie dodać zbyt dużej ilości substratu, co pozwoli uniknąć stronniczości wyników na korzyść szybko rosnących organizmów. Należy również unikać zbyt długiej inkubacji, aby substrat nie rozprzestrzenił się na inne członki społeczności poprzez sieć troficzną.W ten sposób dobiorą Państwo odpowiednią ilość substratu oraz wystarczający czas inkubacji, aby umożliwić wykrycie niewielkich ilości znakowanego DNA w frakcjach ciężkich przy użyciu czułych aplikacji opartych na metodzie PCR. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sondowanie izotopowe DNA (DNA-SIP)

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół użycia sond napięcia opartych na DNA do obrazowania sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe. Takie podejście może mapować siły receptorowe &gt;4,7pN w czasie rzeczywistym i może integrować siły w czasie.

Sondy napięcia DNA do mapowania przejściowych sił receptora pikoningtona przez komórki odpornościowe

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Poznaj metodę sondowania stabilnych izotopów DNA do identyfikacji aktywnych mikroorganizmów bez konieczności ich hodowli. Technika ta pozwala badać metabolizm drobnoustrojów w środowisku naturalnym.

Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

Przeglądaj więcej filmów