Sondowanie stabilnych izotopów DNA (DNA-SIP)

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie DNA z aktywnych mikroorganizmów, które spożyły interesujący nas substrat wzrostowy bez warunku wstępnego hodowli laboratoryjnej. Osiąga się to poprzez uprzednią inkubację próbki środowiskowej z substratem znakowanym stabilnym izotopem w warunkach podobnych do tych, które występują w środowisku rodzimym. Drugim etapem procedury jest ekstrakcja całkowitego DNA z tej próbki znakowanej izotopem.

Trzecim etapem procedury jest poddanie tego DNA ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w chlorku cezu. Ostatnim etapem procedury jest frakcjonowanie gradientu gęstości w celu uzyskania ciężkiego i lekkiego DNA do późniejszej charakterystyki molekularnej. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które ujawniają tożsamość aktywnych, ale niehodowanych mikroorganizmów biorących udział w metabolizmie określonego substratu za pomocą różnych możliwych technik molekularnych, w tym odcisków palców, mikromacierzy, hybrydyzacji, klonowania, analizy bibliotecznej i metagenomiki.

Cześć, nazywam się Josh Neufeld i pracuję na Wydziale Biologii Uniwersytetu Waterloo. Nazywam się Eric Dunford i jestem doktorantem w Newfeld Lab. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę sondowania izotopów DNAS lub DNA sip, która stała się szeroko stosowaną techniką łączenia tożsamości nieznanych i potencjalnie niehodowanych mikroorganizmów z ich zdolnością do wykorzystania interesującego nas substratu wzrostowego.

Używamy tej procedury w laboratorium Newfeld do badania metabolizmu źródeł węgla w różnych środowiskach lądowych i wodnych. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak zastosować konkretny substrat węglowy 13 C glukozy do próbki gleby. Przyznajemy jednak, że od czasu, gdy ta metoda została po raz pierwszy opracowana przez grupę Colina Merle'a z University of Warwick, naukowcy zróżnicowali protokół, aby można go było zastosować do wielu różnych środowisk, a także przy użyciu wielu różnych znakowanych izotopów, takich jak azot i tlen.

Dzisiaj skupimy się na węglu, ale sam protokół można zastosować do różnych projektów eksperymentalnych. Więc zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować wszystkie odczynniki do pomiaru stabilnych izotopów DNA lub odczynniki CYP DNA zgodnie z opisem w pisemnej części niniejszego protokołu.

DNAC rozpoczyna się od inkubacji próbki. Warunki inkubacji różnią się znacznie w zależności od różnych cech próbki i substratu. Po empirycznym określeniu odpowiednich warunków inkubacji, do próbki środowiskowej dodać odpowiednią poprawkę do substratu.

Możesz również zdecydować się na włączenie dodatkowych składników odżywczych, aby umożliwić rozwój drobnoustrojów, jeśli są one wymagane na podstawie inkubacji testowych. Po ustawieniu inkubacji próbki należy zakryć i uszczelnić próbkę, a następnie inkubować próbki środowiskowe zawierające oznakowany substrat. Pokazany przykład polega na dodaniu roztworu glukozy znakowanego węglem 13 do próbki gleby.

Następnie skonfiguruj inkubację kontrolną, która posłuży jako porównanie, aby potwierdzić pozorne znakowanie kwasu nukleinowego obserwowane w kolejnych krokach. Przygotować tę próbkę w identycznych warunkach, z wyjątkiem użycia nieznakowanego węgla jako nasadki substratu, uszczelnić i inkubować próbkę środowiskową z nieznakowanym substratem w tych samych warunkach po inkubacji, ekstrahując DNA z mikrokosmosów przy użyciu protokołu ekstrakcji, który jest odpowiedni dla pożądanych dalszych zastosowań. Następnie oznacz ilościowo wyekstrahowane DNA dla następujących etapów ultrawirowania za pomocą żelu do sous i spektrofotometru.

Używaj wirników pionowych lub prawie pionowych do ultrawirowania, aby zapewnić maksymalną możliwą separację lekkiego i ciężkiego DNA. Rotor Beckman Coulter VTI 65.2 posiada 16 dołków do przechowywania 5,1 mililitrowych rurek polimerowych z szybkozłączem do przygotowania próbek do ultrawirowania. Najpierw oblicz objętość wyekstrahowanego DNA, która jest potrzebna do dodania od 0,5 do pięciu mikrogramów DNA do probówek ultrawirówek.

Korzystając z wcześniej oznaczonych stężeń DNA. Następnie należy określić dokładną gęstość roztworu podstawowego chlorku cezu za pomocą refraktometru cyfrowego. Zgodnie z sugestią zawartą w pisemnym protokole należy obliczyć objętość gradientowego roztworu buforowego DNA wymaganą do wytworzenia odpowiedniego stosunku mieszania.

Korzystając z tych obliczeń, połącz wyekstrahowane DNA z buforem gradientowym i 4,8 mililitra chlorku cezu w sterylnej jednorazowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Uzyskana objętość będzie większa niż określona pojemność probówek wirówkowych, aby całkowicie napełnić probówki. W końcu tworzy rozwiązanie, odwracając rurkę 10 razy warianty tego protokołu.

Użyj siły flory roślinnej, takiej jak ahy i bromek w roztworze gradientowym, aby umożliwić wizualizację DNA w probówce. Zmiana gęstości DNA przygotowanego z czystej hodowli DNA, w tym gradientu bromku AUM, jak pokazano tutaj, jest szczególnie przydatna w celu zapewnienia natychmiastowego wizualnego potwierdzenia tworzenia się gradientu po każdej wirówce. Kroki uruchamiania przy użyciu takiego podejścia są opisane w pisemnym protokole.

Aby najpierw skonfigurować ultrawirowanie, użyj bańki i przełóż pipetę, aby ostrożnie napełnić probówki ultrawirówki roztworami gradientowymi. Oznacz rurki na ramieniu rurki drobnym markerem permanentnym. Upewnij się, że probówki są wypełnione dokładnie do podstawy szyjki probówki, ponieważ niewystarczająco napełnione probówki mają tendencję do pękania podczas ultrawirowania.

Gdy wszystkie wymagane probówki zostaną wypełnione roztworami próbek, zapisz dokładną masę każdej probówki, posortuj probówki jako ściśle pasujące pary i dodaj lub usuń moje nowe ilości roztworu, aż zostaną zrównoważone z dokładnością do 10 miligramów. Utrzymuj roztwór poziomo jak najbliżej podstawy probówki. Następnie uszczelnij probówki za pomocą nakładki na tubki zgodnie z instrukcjami producenta.

Sprawdź, czy rurki są prawidłowo uszczelnione, odwracając je i wywierając umiarkowany nacisk. Ponownie zważyć probówki, aby sprawdzić, czy są nadal wyważone po uszczelnieniu przed ultrawirowaniem. Dokładnie sprawdź każdy wirnik, aby upewnić się, że jest czysty i wolny od kurzu i zanieczyszczeń, które mogłyby przebić probówki podczas ultrawirowania.

Włóż rurki do wirnika, umieszczając wyważone pary naprzeciwko siebie. Zapisz położenie wirnika każdej próbki, ponieważ proces ultrawirowania może sprawić, że etykiety znaczników będą czytelne. Ostrożnie uszczelnij wnęki wirnika zgodnie ze wskazaniami producenta.

Po uszczelnieniu studzienek wirnika załaduj wirnik do ultrawirówki. Zamknij drzwiczki ultrawirówki i zastosuj podciśnienie do wirnika VTI 65.2. Ustaw prędkość obrotową na 44, 100 obr./min, temperaturę na 20 stopni Celsjusza, a czas ultrawirowania na 36 do 40 godzin.

Upewnij się, że podciśnienie jest włączone, wybierz maksymalne przyspieszenie i wyłącz hamulec, aby upewnić się, że nachylenie nie zostanie zakłócone przez zwalnianie. Natychmiast po ultrawirowaniu ostrożnie wyjmij wirnik. Uważaj, aby nie przechylić ani nie uderzyć wirnika, aby nie zakłócić gradientów w rurach.

Na koniec delikatnie wyjmij probówki w celu frakcjonowania gradientowego. DNA można ekstrahować z probówek ultrawirówkowych przy użyciu techniki frakcjonowania. Na początek napełnij sterylną 60-mililitrową strzykawkę sterylną wodą destylowaną i dejonizowaną zawierającą wystarczającą ilość niebieskiego barwnika propofolowego.

Aby uzyskać ciemnoniebieski kolor, umieść strzykawkę na ramieniu ładującym pompy strzykawkowej. Następnie przymocuj rurkę pompy wyposażoną w jednocalową igłę o rozmiarze 23 i włącz pompę, aż trochę wody przepłynie przez koniec igły. Unikaj pęcherzyków powietrza w dopływie wody, ponieważ wpłyną one negatywnie na proces frakcjonowania.

Dla każdej próbki przygotuj 12 sterylnych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra z etykietami wskazującymi numer próbki i frakcję. Następnie szybkim i kontrolowanym ruchem przymocuj jedną z probówek ultrawirówek do stojaka zaciskowego. Przebij spód rurki wzdłuż szwu rurki za pomocą świeżej jednocalowej igły o rozmiarze 23 i obróć igłę, aby upewnić się, że powstał jednolity otwór.

Może się okazać, że rękawice lateksowe zapewniają lepszą przyczepność trzonu igły niż rękawice nitrylowe. Za pomocą igły przymocowanej do rurki pompy przebij górną część rurki na górnym ramieniu rurki wzdłuż szwu w szybki i kontrolowany sposób. Należy pamiętać, że można również przekłuć górną część rurki, a następnie spód rurki.

Należy również pamiętać, że niewielka ilość oleju mineralnego pokrywającego ramię rurki może pomóc w zapobieganiu wyciekom z powodu niewłaściwego uszczelnienia wokół górnej igły przy wcześniej skalibrowanej szybkości pompy. Przepompuj barwioną wodę do górnej części probówki, aby uzyskać 12 425 mikrolitrów frakcji w ciągu 12 minut. Użyj timera, aby zebrać roztwór gradientu w oznaczonych mikroprobówkach wirówkowych.

Na koniec sprawdź gęstość wszystkich frakcji dla co najmniej jednej próbki lub gradientu kontrolnego. Korzystanie z refraktometru cyfrowego. Spodziewaj się wartości w zakresie od 1.690 do 1.760 gramów na mililitr przy medianie gęstości około 1.725 gramów na mililitr, aby wytrącić DNA ze wszystkich frakcji.

Najpierw dodać 20 mikrogramów liniowego poliakrylamidu jako nośnik do wytrącania i wymieszać przez inwersję. Następnie dodaj dwie objętości roztworu PEG i ponownie wymieszaj przez odwrócenie. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na dwie godziny, aby DNA mogło się wytrącić po inkubacji.

Umieszczono próbki w mikrowirówce z probówkami zorientowanymi w tym samym kierunku, aby zapewnić stałą lokalizację wirówki do peletów. Probówki o masie 13 000 G przez 30 minut po odwirowaniu pobierały próbki z mikrowirówki, a następnie ostrożnie zasysały i odrzucały aplikację supernat. Pellet powinien być widoczny na tym etapie za pomocą jasnego źródła światła.

Umyj granulat 500 mikrolitrami 70% etanolu po umyciu wirówki do peletów. Próbki w temperaturze 13 000 G przez 10 minut po odwirowaniu ostrożnie zasysać i odrzucać supernat. Granulka będzie teraz bardziej widoczna, ale łatwiej oddzieli się od ścianki rury.

Pozostaw granulat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po wyschnięciu granulek zawiesić każdy granulat w 50 mikrolitrach bufora TE. Na koniec uruchom pięć mikrolitrów każdej frakcji na żelu aerodynamicznym, aby scharakteryzować frakcje gradientowe przy użyciu metod omówionych w pisemnym protokole.

Typowe wyniki SIP DNA wykażą oddzielenie znakowanego i nieznakowanego DNA w postaci gradientu przez ultrawirowanie. Idealnie byłoby, gdyby istniała pełna rozdzielczość materiału genetycznego o dużej masie cząsteczkowej, takiego jak węgiel 13 i azot 15, w szczególności z materiału nieoznakowanego, unikalnych odcisków palców opartych na PCR związanych z frakcjami od czwartego do ósmego próbek inkubowanych stabilnymi izotopami, ale nie z natywnym substratem. Inkubowane kontrole dostarczają mocnych dowodów łączących określone organizmy z metabolizmem określonego znakowanego substratu, gdy są wykonywane na DNA z dwóch czystych kultur, kąpieli szczepu metylu occus occus i nieznakowanej Sian medi A TCC 10 21, znakowanej nieznakowanym genomowym DNA, rozdzielonym na szanowane frakcje gradientowe o różnych gęstościach.

W tym przykładzie ciężkie DNA znakowane izotopami można zaobserwować we frakcjach od czwartego do piątego, podczas gdy nieznakowane DNA znajduje się w wysokich stężeniach we frakcjach od dziewiątej do dziesiątej. Amplifikowane DNA PCR z tych samych frakcji przeprowadzono przy użyciu denaturacji i gradientowej elektroforezy żelowej lub DGGE i wygenerowano dyskretne wzory prążków odpowiadające dwóm organizmom uwzględnionym w gradiencie. Gęstość frakcji waha się od około 1,580 do 1,759 grama na mililitr i są one pokazane w kolejności malejącej gęstości od lewej do prawej.

I odwrotnie, rozdzielenie izotopów i inkubacji próbek środowiskowych może być trudniejsze do zinterpretowania. Gleby tundrowe z Resolute Bay Canada inkubowano z glukozą znakowaną węglem 12 lub węglem 13 przez okres 14 dni w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Aerożele oczyszczonego gradientowego frakcji DNA ujawniły rozmazane genomowe DNA we frakcji od 7 do 10 zarówno dla inkubacji węgla 12, jak i węgla 13.

Jednakże, gdy DGGE genów rybosomalnego RNA 16 s został wykorzystany do określenia wzbogacenia węgla 13 w biomasę z poszczególnych taksonów drobnoustrojów, gleba inkubowana przez węgiel 12 glukozy, DNA wygenerowała podobne wzorce we wszystkich frakcjach gradientowych, podczas gdy próbka inkubowana przez węgiel 13 glukozy wygenerowała odciski palców DGG, które są jednoznacznie powiązane z frakcjami od piątego do ósmego, Zachowane pasma oznaczone strzałkami reprezentowały dominujący typ filologiczny spójny we wszystkich frakcjach gradientu. Typ filologii przechodzi w cięższe frakcje dla DNA uzyskanego z gleby inkubowanej przez węgiel 13 glukozy. Tożsamość tego konkretnego genu 16-s rybosomalnego RNA może zostać określona w celu kierowania późniejszymi podejściami metagenomicznymi lub opartymi na uprawie.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić eksperyment sondowania stabilnego izotopu DNA, od inkubacji próbek do uzyskania znakowanego DNA do analizy molekularnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dokładnie rozważyć projekt eksperymentu, uważać, aby nie dodać zbyt dużej ilości substratu, aby uniknąć stronniczości eksperymentu w kierunku szybko rosnących organizmów. Należy również uniknąć przedłużonej inkubacji, aby substrat nie rozcieńczał się dla innych członków społeczności za pośrednictwem sieci pokarmowej.

Dlatego chcesz użyć odpowiedniej ilości substratu i wystarczającego czasu inkubacji, aby umożliwić wykrycie niewielkiej ilości znakowanego DNA w ciężkich frakcjach za pomocą czułych aplikacji opartych na PCR. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.