Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odzyskanie DNA z aktywnych mikroorganizmów, które skonsumowały wybrany substrat wzrostowy, bez konieczności wcześniejszej hodowli laboratoryjnej. Osiąga się to poprzez inkubację próbki środowiskowej z substratem znakowanym stabilnym izotopem w warunkach zbliżonych do tych występujących w naturalnym środowisku. Drugim krokiem procedury jest ekstrakcja całkowitego DNA z tej próbki znakowanej izotopowo.

Trzecim krokiem procedury jest poddanie tego DNA ultrawirowaniu w gradiencie gęstości chlorku cezu. Ostatnim etapem procedury jest frakcjonowanie gradientu gęstości w celu uzyskania ciężkiego i lekkiego DNA do późniejszej charakterystyki molekularnej. Ostatecznie, za pomocą różnych dostępnych technik molekularnych, w tym fingerprintingu, mikromacierzy, hybrydyzacji, analizy klonów, bibliotek oraz metagenomiki, można uzyskać wyniki ujawniające tożsamość aktywnych, lecz nieuprawianych w kulturach mikroorganizmów uczestniczących w metabolizmie konkretnego substratu.

Witajcie, jestem Josh Neufeld z Katedry Biologii na Uniwersytecie Waterloo. Jestem Eric Dunford, doktorant w laboratorium Neufelda. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę sondowania izotopowego DNA, czyli DNA-SIP, która stała się powszechnie stosowaną techniką łączącą tożsamość nieznanych i potencjalnie niehodowlanych mikroorganizmów z ich zdolnością do wykorzystywania interesującego nas podłoża wzrostowego.

Stosujemy tę procedurę w laboratorium Newfelda do badania metabolizmu źródeł węgla w różnych środowiskach lądowych i wodnych. Dzisiaj zaprezentujemy zastosowanie konkretnego substratu węglowego, glukozy 13 C, do próbki gleby. Należy jednak zaznaczyć, że od czasu opracowania tej metody przez grupę Colina Merle'a na Uniwersytecie w Warwick, badacze zdywersyfikowali ten protokół, aby można go było stosować w różnych środowiskach oraz z wykorzystaniem różnych izotopów znakowanych, takich jak azot i tlen.

Dzisiaj skupimy się na węglu, jednak sam protokół można zastosować w różnych schematach doświadczalnych. Zatem zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować wszystkie odczynniki do analizy DNA-SIP (DNA stable isotope probing) lub DNA CYP, zgodnie z opisem zawartym w części pisemnej niniejszego protokołu.

DNAC rozpoczyna się od inkubacji próbki. Warunki inkubacji różnią się w zależności od wielu charakterystyk próbek i podłoży. Po empirycznym ustaleniu odpowiednich warunków inkubacji, należy dodać właściwą poprawkę podłoża do próbki środowiskowej.

Można również zdecydować o dodaniu dodatkowych składników odżywczych w celu umożliwienia wzrostu mikroorganizmów, jeśli jest to wymagane na podstawie inkubacji testowych. Po przygotowaniu inkubacji próbki, należy zakręcić i uszczelnić naczynie, a następnie inkubować próbki środowiskowe zawierające znakowane podłoże. Przedstawiony przykład obejmuje dodanie roztworu glukozy znakowanej węglem 13 do próbki gleby.

Następnie należy przygotować inkubację kontrolną, która posłuży jako punkt odniesienia do potwierdzenia widocznego znakowania kwasów nukleinowych zaobserwowanego w kolejnych etapach. Próbkę tę należy przygotować w identycznych warunkach, z wyjątkiem zastosowania nieznakowanego węgla jako podłoża; próbkę środowiskową z nieznakowanym podłożem należy szczelnie zamknąć i inkubować w tych samych warunkach. Po inkubacji należy wyekstrahować DNA z mikrokosmosów, stosując protokół ekstrakcji odpowiedni dla planowanych dalszych zastosowań. Następnie należy określić ilość wyekstrahowanego DNA do kolejnych etapów ultrawirowania, wykorzystując żel agarozowy oraz spektrofotometr.

Do ultracentryfugacji należy używać rotorów pionowych lub niemal pionowych, aby zapewnić maksymalną możliwą separację lekkiego i ciężkiego DNA. Rotor Beckman Coulter VTI 65.2 posiada 16 otworów na polimerowe probówki z szybkim uszczelnieniem o pojemności 5,1 mililitra do przygotowania próbek do ultracentryfugacji. W pierwszej kolejności należy obliczyć objętość wyekstrahowanego DNA wymaganą do dodania od 0,5 do 5 mikrogramów DNA do probówek do ultracentryfugacji.

Wykorzystując wcześniej określone stężenia DNA. Następnie należy oznaczyć dokładną gęstość roztworu zapasowego chlorku cezu za pomocą cyfrowego refraktometru. Zgodnie z sugestią w protokole pisemnym, należy obliczyć objętość roztworu DNA w buforze gradientowym wymaganą do uzyskania odpowiedniego stosunku mieszania.

Wykorzystując te obliczenia, połącz wyekstrahowane DNA z buforem gradientowym i 4,8 mililitrów chlorku cezu w sterylnym jednorazowym probówce o pojemności 15 mililitrów. Otrzymana objętość będzie większa niż określona pojemność probówek do wirówki, aby całkowicie je wypełnić. Na koniec wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 10 razy zgodnie z wariantami tego protokołu.

Aby umożliwić wizualizację DNA w probówce, w roztworze gradientu należy zastosować barwnik fluorescencyjny, taki jak bromek etydyny. Zmiana gęstości DNA podczas przygotowania go z czystą kulturą DNA, w tym zastosowanie gradientu bromku etydyny, jak pokazano tutaj, jest szczególnie przydatna do natychmiastowego wizualnego potwierdzenia utworzenia gradientu po każdym wirowaniu. Kroki procedury z zastosowaniem tego podejścia zostały opisane w protokole pisemnym.

Aby przygotować ultrawirowarkę, należy najpierw użyć gruszki i pipety Pasteura, aby ostrożnie napełnić probówki do ultrawirowania roztworami gradientowymi. Probówki należy opisać na ich ramionach za pomocą cienkiego pisaka permanentnego. Należy upewnić się, że probówki są napełnione dokładnie do podstawy szyjki, ponieważ niedopełnione probówki mają tendencję do pękania podczas ultrawirowania.

Po napełnieniu wszystkich wymaganych probówek roztworami próbek należy zapisać dokładną masę każdej z nich, a następnie posortować probówki w pary o najbardziej zbliżonej masie i dodawać lub usuwać niewielkie ilości roztworu, aż różnica między nimi nie przekroczy 10 mg. Należy utrzymywać poziom roztworu jak najbliżej podstawy probówki. Następnie probówki należy zamknąć za pomocą zatyczek zgodnie z instrukcją producenta.

Sprawdzić, czy probówki są szczelnie zamknięte, odwracając je i wywierając umiarkowany nacisk. Ponownie zważyć probówki, aby upewnić się, że po zamknięciu są nadal zrównoważone przed ultrawirowaniem. Dokładnie sprawdzić każde gniazdo rotora, aby upewnić się, że są czyste i wolne od kurzu oraz zanieczyszczeń, które mogłyby przebić probówki podczas ultrawirowania.

Włóż probówki do rotora, umieszczając zrównoważone pary naprzeciw siebie. Zapisz położenie każdej próbki w rotorze, ponieważ proces ultrawirowania może sprawić, że etykiety z oznaczeniami staną się nieczytelne. Ostrożnie uszczelnij otwory rotora zgodnie z instrukcjami producenta.

Po uszczelnieniu otworów wirnika, umieść go w ultrawirówce. Zamknij pokrywę ultrawirówki i wytwórz próżnię dla wirnika VTI 65.2. Ustaw prędkość obrotową na 44 100 RPM, temperaturę na 20 °C, a czas ultrawirowania na od 36 do 40 godzin.

Upewnij się, że pompa próżniowa jest włączona, wybierz maksymalne przyspieszenie i wyłącz hamulec, aby zapobiec zaburzeniu gradientu przez decelerację. Bezpośrednio po ultracentryfugacji ostrożnie wyjmij wirnik. Należy uważać, aby nie przechylić ani nie uderzyć wirnika, aby uniknąć naruszenia gradientów w probówkach.

Na koniec delikatnie wyjmij probówki do frakcjonowania gradientowego. DNA można wyekstrahować z probówek do ultrawirówki, stosując technikę frakcjonowania. Aby rozpocząć, napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 60 milliliter sterylną wodą destylowaną i dejonizowaną zawierającą odpowiednią ilość barwnika propofol blue.

Aby uzyskać ciemnoniebieski kolor, należy umieścić strzykawkę na ramieniu ładującym pompy strzykawkowej. Następnie podłączyć przewody pompy z dopasowaną igłą 23G o długości jednego cala i włączyć pompę, aż woda zacznie wypływać z końcówki igły. Należy unikać pęcherzyków powietrza w dopływie wody, ponieważ będą one negatywnie wpływać na proces frakcjonowania.

Dla każdej próbki przygotuj 12 sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra z etykietami wskazującymi numer próbki i frakcję. Następnie, szybkim i kontrolowanym ruchem przymocuj jedną z probówek do wirowania w ultacentryfudze do statywu z zaciskiem. Przebij dno probówki wzdłuż jej szwu, używając nowej igły 23 gauge o długości jednej cala, a następnie obróć igłę, aby upewnić się, że powstał otwór o jednolitym kształcie.

Można zauważyć, że rękawiczki lateksowe zapewniają lepszy chwyt trzpienia igły niż rękawiczki nitrylowe. Używając igły przymocowanej do drenu pompy, w sposób szybki i kontrolowany przebij górną część rurki na górnym ramieniu rurki wzdłuż szwu. Należy zaznaczyć, że można również najpierw przebić górną, a następnie dolną część rurki.

Należy również zauważyć, że niewielka ilość oleju mineralnego pokrywającego bark probówki może pomóc zapobiec wyciekom wynikającym z nieprawidłowego uszczelnienia wokół górnej igły przy wcześniej skalibrowanej prędkości pompowania. Pompuj barwioną wodę do górnej części probówki, aby uzyskać 12 frakcji po 425 µl w ciągu 12 minut. Użyj stopera, aby zebrać roztwór gradientowy do oznakowanych probówek do mikrowirówki.

Na koniec sprawdź gęstość wszystkich frakcji dla co najmniej jednej próbki lub gradientu kontrolnego, używając cyfrowego refraktometru. Oczekiwane wartości powinny mieścić się w przedziale od 1,690 do 1,760 g/mL, z gęstością średnią wynoszącą około 1,725 g/mL, aby wytrącić DNA ze wszystkich frakcji.

Najpierw należy dodać 20 µg liniowej poliakryloamidu jako nośnika do precypitacji i wymieszać poprzez odwracanie probówek. Następnie dodaje się dwie objętości roztworu PEG i ponownie miesza przez odwracanie. Probówki pozostawia się w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby po inkubacji DNA uległo precypitacji.

Umieść próbki w mikrocentryfodze, orientując probówki w tym samym kierunku, aby zapewnić spójną lokalizację osadu po wirowaniu. Wirowano probówki przy 13 000 G przez 30 minut; po wirowaniu wyjęto próbki z mikrocentryfogi, a następnie ostrożnie odessano i usunięto nadsącz. Osad powinien być na tym etapie widoczny przy użyciu jasnego źródła światła.

Po odwirowaniu osadu wypłucz go 500 µL 70% etanolu. Próbki odwiruj przy 13 000 G przez 10 minut, a następnie ostrożnie odessaj i usuń supernatant. Osad będzie teraz bardziej widoczny, ale będzie się łatwiej oddzielać od ścianki probówki.

Pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po wyschnięciu osadów zawieś każdy z nich w 50 µL buforu TE. Na koniec nałóż 5 µL każdej frakcji na żel agarozowy, aby scharakteryzować frakcje gradientu, stosując metody omówione w protokole pisemnym.

Typowe wyniki DNA SIP wykażą rozdzielenie znakowanego i nieznakowanego DNA w gradiencie za pomocą ultrawirowania. W idealnym przypadku nastąpi całkowita rozdzielność wysokocząsteczkowego materiału genetycznego, takiego jak ten znakowany węglem 13 i azotem 15, od materiału nieznakowanego; w szczególności pojawią się unikalne profile PCR powiązane z frakcjami od czwartej do ósmej w próbkach inkubowanych z izotopami stabilnymi, których nie będzie w próbkach z substratem naturalnym. Kontrole inkubowane dostarczają silnych dowodów łączących konkretne organizmy z metabolizmem danego znakowanego substratu; gdy badanie przeprowadzono na DNA z dwóch kultur czystych – znakowanego węglem 13 szczepu Methylococcus capsulatus bath oraz nieznakowanego S. methylotrophicus ATCC 1021 – znakowane i nieznakowane DNA genomowe rozdzieliły się do odpowiednich frakcji gradientu o różnych gęstościach.

W tym przykładzie DNA znakowane ciężkimi izotopami można zaobserwować w frakcjach od czwartej do piątej, natomiast DNA nieznakowane występuje w wysokich stężeniach w frakcjach od dziewiątej do dziesiątej. DNA z tych samych frakcji, powielone metodą PCR, poddano denaturującej elektroforezie w żelu gradientowym (DGGE), co pozwoliło uzyskać wyraźne wzory prążków odpowiadające dwóm organizmom zawartym w gradiencie. Gęstość frakcji mieści się w zakresie od około 1,580 do 1,759 g/ml i są one przedstawione w kolejności malejącej gęstości od lewej do prawej.

Z drugiej strony, rozdzielenie izotopów oraz inkubacje próbek środowiskowych mogą być trudniejsze do interpretacji. Gleby tundry z Resolute Bay w Kanadzie inkubowano przez 14 dni w temperaturze 15 °C z glukozą znakowaną węglem 12 lub węglem 13. Obrazy AeroGel oczyszczonej frakcji DNA z gradientu wykazały rozmazany obraz genomowego DNA w frakcjach od 7 do 10 dla inkubacji zarówno z węglem 12, jak i węglem 13.

Jednakże, gdy zastosowano DGGE genów 16 s rRNA w celu określenia wzbogacenia biomasy w węgiel 13 dla konkretnych taksonów mikrobiologicznych, DNA z gleby inkubowanej z glukozą z węglem 12 wygenerowało podobne wzorce we wszystkich frakcjach gradientu, podczas gdy próbka inkubowana z glukozą z węglem 13 wygenerowała profile DGGE jednoznacznie powiązane z frakcjami od piątej do ósmej; zachowane prążki wskazane strzałkami reprezentowały dominujący filotyp spójny we wszystkich frakcjach gradientu. Filotyp przesuwa się w stronę cięższych frakcji dla DNA uzyskanego z gleby inkubowanej z glukozą z węglem 13. Tożsamość tego konkretnego genu 16 s rRNA może zostać określona, aby ukierunkować późniejsze podejścia metagenomiczne lub oparte na hodowli.

Właśnie przedstawiliśmy sposób przeprowadzenia eksperymentu stabilnego znakowania izotopowego DNA (DNA stable isotope probing), od inkubacji próbek po uzyskanie znakowanego DNA do analizy molekularnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest uważne zaplanowanie przebiegu doświadczenia oraz dbałość o to, aby nie dodać zbyt dużej ilości substratu, co pozwoli uniknąć stronniczości wyników na korzyść szybko rosnących organizmów. Należy również unikać zbyt długiej inkubacji, aby substrat nie rozprzestrzenił się na inne członki społeczności poprzez sieć troficzną.

W ten sposób dobiorą Państwo odpowiednią ilość substratu oraz wystarczający czas inkubacji, aby umożliwić wykrycie niewielkich ilości znakowanego DNA w frakcjach ciężkich przy użyciu czułych aplikacji opartych na metodzie PCR. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.