Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

W niniejszym filmie przedstawiono mikrodysekcję siatkówki oraz siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE) z embrionów danio pręgowanego w pierwszym do trzeciego dnia po zapłodnieniu. Wszystkie procedury można przeprowadzić przy użyciu precyzyjnych pęset i ogólnych materiałów laboratoryjnych. Podczas dysekcji siatkówki pod standardowym mikroskopem stereoskopowym, jednowarstwowy RPE jest usuwany i oddzielany poprzez ruchy zamiatania oraz przyleganie RPE do powierzchni płytki hodowlanej.

W przypadku dyssekcji siatkówki przytwierdzonej do RPE, właściwości adhezyjne płytki hodowlanej są usuwane poprzez zmiażdżenie embrionu i przemywanie przed przystąpieniem do dyssekcji. Aby zachować nienaruszoną strukturę RPE, ostrożne uniesienie tej tkanki pozwala na efektywne oddzielenie naczyniówki i twardówki od siatkówki przytwierdzonej do RPE, po czym następuje usunięcie soczewki za pomocą chemicznie trawionej igły wolframowej. Ta metoda dyssekcji pozwala na uzyskanie nienaruszonych tkanek siatkówki i była z sukcesem wykorzystywana do badania tkankowo specyficznej ekspresji RNA oraz profili siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki u danio pręgowanego.

Witajcie, nazywam się Li Jang i reprezentuję laboratorium profesora UFE Leona z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Purdue. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przeprowadzić sekcję tkanek embrionalnego oka danio pręgowanego. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania sieci genetycznej regulującej rozwój oka.

Zacznijmy zatem. Osiem. Przed mikrodysekcją należy przygotować następujące roztwory: E3, medium, sterylizowany przez filtr roztwór Ringera oraz 5N wodorotlenek sodu.

Następnie należy przeprowadzić trawienie chemiczne igieł wolframowych. Umieść mały zlew w szalce Petriego, stabilizując go gliną, aby ułatwić manipulowanie zlewem i zapobiec rozlaniu wodorotlenku sodu. Do boku zlewka przymocuj standardowy spinacz do papieru.

Wlej do zlewki pięć normalny wodorotlenku sodu, aż spinacz znajdzie się w kontakcie z wodorotlenkiem sodu. Podłącz ujemną elektrodę z zasilacza prądu stałego do spinacza, a dodatnią elektrodę do jednego końca krótkiego odcinka drutu wolframowego. Owiń drugi koniec drutu wolframowego kulką z gliny o średnicy czterech milimetrów i zanurz ten koniec w roztworze wodorotlenku sodu.

Zwiększ napięcie do około trzech woltów i zanurzaj drut w górę i w dół w roztworze wodorotlenku sodu w odstępach jednosekundowych przez około 10 minut. Drut wolframowy wystawiony na działanie wodorotlenku sodu będzie stopniowo cieńszy, gdy kulka gliny odpadnie z drugiej strony drutu przymocowanego do elektrody dodatniej, przyjmując kształt ostrej igły. Przepłucz ostrą igłę roztworem Ringera lub E3, aby usunąć osady soli, a następnie przymocuj igłę do drewnianego aplikatora za pomocą taśmy lub uchwytu do igieł w celu ułatwienia manipulacji podczas przygotowywania embrionów do sekcji.

Utrzymuj dorosłe super fish zgodnie ze standardowymi protokołami w noc poprzedzającą rozród. Rozdziel ryby rodzicielskie w statycznych zbiornikach hodowlanych na pary, używając przegrody. Usuń przegrodę następnego dnia rano po zapaleniu światła w pomieszczeniu i pozwól rodzicom na krzyżowanie w 10-minutowych odstępach co pół godziny, rozdzielając ryby po każdym krzyżowaniu.

Zaroby z każdego krzyżowania należy utrzymywać oddzielnie w pożywce E3 w temperaturze 28°C. Etap rozwoju embrionów należy określić od 10 do 12 godzin po zapłodnieniu, a następnie ponownie go zweryfikować bezpośrednio przed sekcją w określonych punktach czasowych. Do sekcji należy użyć polistyrenowych płytek hodowlanych Falcon 60 × 15 mm.

Nowa, nieużywana płytka wykazuje naturalną właściwość adhezyjną względem tkanki RPE przez około 20 minut, co może ułatwić usuwanie RPE podczas dyssekcji siatkówki. Jeśli pożądane jest pozostawienie siatkówki z przytwierdzonym RPE, właściwość adhezyjną tę można zniwelować poprzez całkowite zmiażdżenie dwóch embrionów w płytce hodowlanej zawierającej roztwór ringera i pozostawienie ich na 30 minut przed dyssekcją, a następnie dokładne przemycie świeżym roztworem ringera przed przystąpieniem do zabiegu. Wszystkie precyzyjne dyssekcje są wykonywane przy powiększeniu od pięciu do ośmiu x przy użyciu mikroskopu Olympus SC X 16 z obiektywem jeden x.

Używając pęsety Dumont lub chemicznie trawionej igły wolframowej, należy podgrzać stolik mikroskopu do 28°C. Aby zminimalizować wpływ wahań temperatury przed rozpoczęciem sekcji siatkówki, należy przenieść embrion na określonym etapie rozwoju do 5 mL roztworu Ringera w płytce hodowlanej Falcon 60 × 15 mm, przygotowanej zgodnie z opisem dla sekcji siatkówki bez RRPE. Za pomocą ostrej końcówki pęsety należy szybko odciąć głowę i część przedniego tułowia, usuwając ciało danio pręgowanego. Następnie należy przypiąć tylny koniec sekcji głowy i tułowia do płytki hodowlanej. Pomocniczą pęsetą należy otworzyć głowę od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.

Usunąć mózg w taki sposób, aby przyśrodkowa strona oczu została odsłonięta i była skierowana ku górze w celu dalszych manipulacji. Aby wypreparować siatkówkę, użyć końcówki pęsety do ostrożnego omiatania odsłoniętego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na przyśrodkowej stronie oka skierowanej ku górze, aż do momentu pojawienia się niewielkiego otworu w siatkówce. Kontynuować omiatanie i oddzielanie, aż przyśrodkowa strona siatkówki zostanie niemal całkowicie odsłonięta.

Należy unikać zadrapania i przebicia odsłoniętej siatkówki podczas usuwania bocznego RPE z siatkówki oka skierowanego w stronę naczynia hodowlanego. Przyjąć kąt około 45 stopni względem powierzchni płytki hodowlanej i delikatnie przesunąć pęsetą po oku. Usunąć RPE, który jest stosunkowo mocno przytwierdzony do ora serrata, przytwierdzając oddzieloną część RPE do płytki hodowlanej w celu przeprowadzenia sekcji.

Następnie delikatnie unieś siatkówkę, aby oczyścić pozostałości RPE i usuń soczewkę, wykorzystując właściwości adhezyjne szalki hodowlanej. Należy uważać, aby nie uszkodzić komórek siatkówki, które również będą lekko przylegać do powierzchni szalki. Jeśli soczewka nie odseparuje się podczas toczenia, użyj trawionej igły wolframowej, wykonując ruch obrotowy na powierzchni soczewki.

Aby rozpocząć sekcję siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE), należy użyć płytki hodowlanej Falcon 60 by 15 mm przygotowanej zgodnie z opisem dla sekcji siatkówki z przytwierdzonym RPE. Przenieść embrion na konkretnym etapie rozwoju do 5 ml roztworu Ringera. Odciąć głowę oraz część przedniej części tułowia.

Szybkie usunięcie ciała danio pręgowanego, zgodnie z wcześniejszą procedurą. Przytwierdzenie tylnego końca sekcji głowy i tułowia do płytki hodowlanej. Za pomocą pęsety pomocniczej otwarcie głowy od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.

Usunąć mózg w taki sposób, aby przyśrodkowa strona oczu była odsłonięta i skierowana do góry. W celu dalszych manipulacji pęsetą, delikatnie unieść oko od tylnej strony bocznej i obrócić je w stronę przednią. Tkanka naczyniówki i twardówki znajdująca się na zewnątrz warstwy RPE jest przymocowana stosunkowo ściśle do skóry i można ją w większości oddzielić, ostrożnie obracając oko w stronę przednią.

Usuń soczewkę za pomocą igły wolframowej, gdy boczna strona oka zostanie odsłonięta, a oko wciąż pozostaje przytwierdzone do skóry w celu przeprowadzenia sekcji siatkówki. Bez RPE oraz siatkówki z przytwierdzonym RPE, wypreparowane próbki można zebrać w triolu w mikroprobówce do RNA w celu późniejszej charakterystyki RNA.

Przedstawiono tutaj udaną dyssekcję siatkówki bez nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE), w której zachowano integralność siatkówki, co wskazuje nienaruszona powierzchnia siatkówki. Odpowiadający jej przekrój histologiczny wykazuje również, że architektura siatkówki jest bardzo dobrze zachowana. W szczególności wyjątkowo dobra jest konserwacja macierzy zewnątrzkomórkowej pomiędzy warstwą fotoreceptorów a RPE.

Pomyślna dyssekcja siatkówki z przytwierdzonym RPE objawia się nienaruszoną i ciągłą warstwą RPE. Odpowiadający jej przekrój histologiczny wykazuje, że zarówno komórki siatkówki, jak i komórki RPE są w dobrym stanie. Całkowite RNA wyekstrahowane z dyssekowanych siatkówek charakteryzuje się wysoką jakością.

Wskazuje na to elektroforegram oraz obraz żelu uzyskane z analizy bioanalizatorem. Linia bazowa jest płaska, a piki rybosomalne 18 s i 28 s są nienaruszone. Wskaźnik integralności RNA (RNA integrity number) jest zazwyczaj większy niż 9,8.

Właśnie zaprezentowaliśmy procedury mikrodyssekcji służące do pozyskiwania siatkówki embrionalnej danio pręgowanego z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE) oraz bez niego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że najbardziej krytycznymi krokami w dyssekcji siatkówki są ruchy zamiatające końcówką pęset oraz rolowanie tkanki. W przypadku usuwania pozostałości RPE zauważyliśmy, że oparcie łokci o regulowane podłokietniki krzesła podczas dyssekcji może znacząco ustabilizować ruchy dłoni.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.