Name: Mikrodysekcja embrionalnych tkanek oczu danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Naucz się mikrodysekcji siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki z embrionów danio pręgowanego w wieku 1–3 dni po zapłodnieniu. Ta metoda pozwala na izolację nienaruszonych tkanek do badań ekspresji RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana z funduszy startowych Departamentu Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Purdue.

Część 1: Przygotowania przed mikrodysekcją 
<ol>
	<li>Roztwory
	<ol class="lalpha">
		<li>pożywka E34 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 oraz 0.33 mM MgSO4).</li> 
		<li>roztwór Ringera1, 5 (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH7.2), sterylizowany przez filtrację.</li> 
		<li>5N NaOH.</li>
	</ol>
	</li> 
	<li>Trawienie chemiczne igieł wolframowych 
	<ol class="lalpha"> 
		<li>Zabezpieczyć mały zlew z 5N NaOH na szalce Petriego za pomocą glinki.</li> 
		<li>Przymocować spinacz biurowy do boku zlewka tak, aby stykał się z roztworem NaOH.</li> 
		<li>Podłączyć elektrodę ujemną z zasilacza DC do spinacza, a elektrodę dodatnią do jednego końca krótkiego odcinka (~2cm) drutu wolframowego.</li> 
		<li>Owinąć drugi koniec drutu wolframowego małą kuleczką glinki i zanurzyć ten koniec w roztworze NaOH.</li> 
		<li>Zwiększyć napięcie do około 3V i zanurzać drut w górę i w dół w roztworze NaOH, aż do uzyskania odpowiedniej prędkości trawienia. Igłę wysokiej jakości można zazwyczaj wytrawić w ciągu 10 minut.</li> 
		<li>Drut wolframowy wystawiony na działanie roztworu będzie stopniowo cieńszy. W momencie odpadnięcia kuleczki glinki, druga strona drutu, która nadal jest przymocowana do elektrody dodatniej, będzie miała kształt ostrej igły.</li> 
		<li>Przepłukać ostrą igłę roztworem Ringera lub pożywką E3, aby usunąć osady soli.</li> <li>Przymocować igłę do drewnianego aplikatora za pomocą taśmy lub uchwytu do igieł w celu ułatwienia manipulacji.</li> 
	</ol>
	</li> 
	<li>Płytki hodowlane 
	<ol class="lalpha"> 
		<li>Polistyrenowe płytki hodowlane Falcon 60 x 15 mm są gotowe do użycia w mikrodysekcji siatkówki.</li>
		<li>W celu wycięcia siatkówki przylegającej do RPE, na 30 minut przed dysekcją całkowicie rozgnieść dwa embriony w płytce hodowlanej zawierającej roztwór Ringera, aby zniwelować lepkość powierzchni. Tuż przed dysekcją dokładnie wypłukać płytkę świeżym roztworem Ringera.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Zbiór i etapowanie embrionów 
	<ol class="lalpha">
		<li>Dorosłe danio pręgowane są utrzymywane zgodnie z opisem4, 5.</li>
		<li>W noc poprzedzającą rozród rozdzielić ryby rodzicielskie w statycznych zbiornikach hodowlanych parami za pomocą przegrody.</li>
		<li>Usunąć przegrodę następnego ranka po włączeniu światła w pomieszczeniu. Pozwolić rodzicom na krzyżowanie się w 10-minutowych odstępach co pół godziny. Rozdzielać ryby po każdym krzyżowaniu.</li>
		<li>Embriony zebrane z każdego krzyżowania utrzymywać oddzielnie w pożywce E3 w temperaturze 28°C.</li>
		<li>Etapować embriony w 10 do 12 godzin po zapłodnieniu (hpf) i ponownie etapować bezpośrednio przed dysekcją w określonych punktach czasowych, zgodnie z ustalonymi kryteriami1, 6.</li>
	</ol>
	</li> 
</ol>
Część 2: Disekcja – usunięcie mózgu i odsłonięcie oczu1
<ul>
	<li>Procedury opisane w tej sekcji są wspólne dla preparowania siatkówki (Część 3A) oraz siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE) (Część 3B).</li>
	<li>Wszystkie precyzyjne etapy preparowania są wykonywane za pomocą końcówki pęsety Dumont, z wykorzystaniem drugiej pęsety Dumont do pozycjonowania tkanki. W razie potrzeby do bardziej precyzyjnych manipulacji można użyć chemicznie trawionej igły wolframowej.</li>
	<li>Wszystkie precyzyjne etapy preparowania są wykonywane przy powiększeniu ~ 5-8x pod mikroskopem Olympus SZX16 wyposażonym w obiektyw 1X lub odpowiednik.</li>
	<li>Zarodki należy utrzymywać w medium E3 w inkubatorze laboratoryjnym w temperaturze 28°C obok mikroskopu, aby zapewnić łatwy dostęp do nich podczas preparowania.</li>
	<li>Stolik mikroskopu jest podgrzewany do 28°C za pomocą płyty termicznej, aby zminimalizować wpływ wahań temperatury na ekspresję genów.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Przenieś embrion na określonym etapie rozwoju do roztworu Ringera w płytce hodowlanej Falcon 60 x 15 mm przygotowanej zgodnie z opisem w części 1#3.</li>
	<li>Szybko odetnij głowę wraz z częścią przedniego tułowia od reszty ciała.</li>>
	<li>Przymocuj tylny koniec tej tkanki do płytki hodowlanej za pomocą pęsety pomocniczej.</li>
	<li>Otwórz głowę od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.</li>
	<li>Usuń mózg w taki sposób, aby przyśrodkowa strona oczu została odsłonięta i była skierowana do góry w celu dalszych manipulacji.</li>
</ol>
 Część 3A: Disekcja siatkówki1
 <ol> 
	<li>Przygotować zarodek zgodnie z opisem w Części 2.</li>
	<li>Ostrożnie przesuwać końcówką pęsety po odsłoniętym RPE na stronie przyśrodkowej gałki ocznej skierowanej ku górze, aż do momentu zauważenia niewielkiego otworu w siatkówce.</li>
	<li>Kontynuować szczotkowanie i odwarstwianie, aż strona przyśrodkowa siatkówki zostanie niemal całkowicie odsłonięta. Należy unikać zadrapiania i przebijania odsłoniętej siatkówki.</li>
	<li>Aby usunąć boczny RPE z siatkówki, która znajduje się teraz stroną dolną do dołu, należy przystąpić do zabiegu pod kątem około 45° względem powierzchni płytki hodowlanej.</li>
	<li>Usunąć RPE, który jest stosunkowo mocno przyczepiony do ora serrata, przytwierdzając oddzieloną część RPE do płytki hodowlanej w celu dissekcji, a następnie delikatnie unieść siatkówkę.</li>
	<li>Przetaczać siatkówkę po dnie naczynia hodowlanego, aby oczyścić ją z pozostałości RPE. 
	<ol class="lalpha"> 
		<li>Zauważono, że ta konkretna polistyrenowa płytka hodowlana Falcon wykazuje preferencyjną adhezję RPE przez około 20 minut po zmiażdżeniu zarodka. Właściwość ta jest wykorzystywana do usuwania resztek RPE. Jednakże komórki siatkówki również przylegają do powierzchni w mniejszym stopniu, co można dokładnie sprawdzić pod dużym powiększeniem. Należy zachować równowagę między całkowitością usunięcia RPE a integralnością siatkówki.</li>
		<li>Soczewka często przylega do płytki hodowlanej i oddziela się od siatkówki podczas procesu przetaczania. Sporadycznie konieczne jest oddzielenie soczewki za pomocą trawionej igły wolframowej, wykonując koliste ruchy na powierzchni soczewki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedury te pozwalają na skuteczne usunięcie RPE z siatkówki bez naruszania integralności tkanki. Wskazuje na to dobra ogólna morfologia (Rysunek 1B i B') oraz histologia (Rysunek 1B"). W szczególności wyjątkowo dobrze zachowana jest macierz zewnątrzkomórkowa pomiędzy warstwą fotoreceptorów a RPE (Rysunek 1B", strzałka; porównać z histologią całego zarodka (Rysunek 1A")).</li>
</ol>
Część 3B: Disekcja siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE)3 
<ol>
	<li>Przygotować embrion zgodnie z opisem w części 2.</li>
	<li>Przymocować głowę do płytki hodowlanej za pomocą pincety pomocniczej. Delikatnie unieść oko od strony bocznej tylnej i przetoczyć je w stronę przednią.
	<ol class="lalpha">
		<li>Tkanka przypuszczalnej błony naczyniowej i twardówki znajdująca się na zewnątrz warstwy RPE przylega stosunkowo ściśle do skóry i może zostać w większości oddzielona poprzez ostrożne przetoczenie oka w stronę przednią.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć soczewkę za pomocą igły wolframowej po odsłonięciu bocznej strony oka, gdy oko jest nadal przymocowane do skóry.</li>
	<li>Procedury te pozwalają na skuteczne zachowanie całej warstwy RPE wraz z siatkówką. Tkanki przypuszczalnej błony naczyniowej i twardówki można w znacznym stopniu usunąć (Rysunek 1C, C' i C").</li>
</ol>
Część 4: Pobieranie próbek tkanek do analizy RNA
<ol>
	<li>Wypreparowane próbki można zebrać w odczynniku TRIzol w probówce mikrocentryfugowej wolnej od RNaz w celu późniejszej charakterystyki RNA, zgodnie z wcześniejszym opisem1.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="Sekwencyjny rozwój zarodka; obrazy mikroskopowe; analiza różnicowania komórkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. (A) Widok boczny i (A') grzbietowy głowy larwy danio pręgowanego w 52 hpf przed sekcją. (A") Odpowiadający przekrój histologiczny głowy larwy z (A) i (A'). (B) Widok boczny i (B') grzbietowy wypreparowanej siatkówki w 54 hpf. Powierzchnia siatkówki pozostała nienaruszona zarówno w widoku bocznym, jak i grzbietowym. (B") Odpowiadający przekrój histologiczny wypreparowanej siatkówki z (B) i (B'). Struktura siatkówki oraz jej laminacja były zachowane. W szczególności macierz pozakomórkowa między warstwą fotoreceptorów a RPE (A", strzałki) była dobrze zachowana w wypreparowanej siatkówce (B", strzałki). (C) Widok boczny i (C') przyśrodkowy wypreparowanej siatkówki z przytwierdzonym RPE w 52 hpf. Warstwa RPE była nienaruszona i ciągła, co potwierdził również przekrój histologiczny wypreparowanej tkanki (C"). Biały obszar w C' to nerw wzrokowy (strzałka). Do badań histologicznych pobrano próbki tkanek i utrwalono je w 4% paraformaldehydzie. Zatapianie w plastiku i krojenie tych próbek wykonano zgodnie z opisem3. Pasek skali = 50 μm.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Purdue Animal Care and Use Committee.

Mikrodysekcja tkanek oka danio pręgowanego pozwala na skuteczne pozyskanie nienaruszonych siatkówek oraz siatkówek z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE). Znacznie ułatwia to badania ekspresji dotyczące konkretnej tkanki oka (tj. siatkówki lub RPE). W rzeczywistości z powodzeniem wykorzystaliśmy te procedury do uzyskania profili ekspresji RNA całej siatkówki1 oraz RPE3. Użyteczność tych profili została silnie potwierdzona przez naszą niedawną identyfikację szlaków i rodzin genów, k...

<table><tbody><tr><td>Bezprzewodowy silnik do tłuczka</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz prądu stałego</td><td>Lascar</td><td>PSU130</td><td>Każde zasilanie prądem stałym będzie odpowiednie. W przypadku innego urządzenia konkretne napięcie będzie wymagało dodatkowej optymalizacji.</td></tr><tr><td>Jednorazowy tłuczek &amp;probówka typu microtube, 1,5 ml (wolna od DNazy, RNazy i pirogenów)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>Służą one do pobierania tkanek do odczynnika TRIzol w celu analizy ekspresji.</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5, końcówki: 0,05 x 0,01 mm, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>Pożądany jest niewielki wymiar końcówki, jednak nie jest on bezwzględny, ponieważ może zajść potrzeba okresowego ostrzenia końcówki.</td></tr><tr><td>pinceta Dumont #5SF, końcówki: 0,025 x 0,005 mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Pożądany jest niewielki wymiar końcówki, jednak nie jest on sztywno określony, ponieważ może zajść potrzeba okresowego ostrzenia końcówki.</td></tr><tr><td>płytki hodowlane polistyrenowe Falcon, 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>Płytki te są wykorzystywane jako płytki do sekcji.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop Olympus SZX16</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>Można zastosować dowolny stereomikroskop. W poprzednich badaniach wykorzystaliśmy stereomikroskop marki Leica.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; bez żadnych problemów. Do samej dyssekcji używamy wyłącznie obiektywu 1X, mimo że zainstalowany jest również obiektyw 2X. </td></tr><tr><td>Kamień ostrzący</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>W razie potrzeby należy użyć tego narzędzia do zaostrzenia końcówki pęsety.</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>Służy to do utrzymania temperatury tkanki podczas całej dyssekcji oraz do zminimalizowania wpływu wahań temperatury na ekspresję genów. Cały mikroskop umieściliśmy również w pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych w temperaturze 28°C.&amp;#x00B0;C podczas sekcji w poprzednich badaniach&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; z pomyślnym rezultatem.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>drut wolframowy, średnica 0,015 cala</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator drewniany</td><td>Purytanin</td><td>807</td><td>Służy do mocowania chemicznie trawionej igły wolframowej.</td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym w badaniach nad rozwojem oka ze względu na jego szybkiex uterorozwój oraz wysoka płodność. Do 3 dni po zapłodnieniu (dpf) larwy wykazują pierwszą reakcję wzrokową. Zidentyfikowano wiele genów kontrolujących prawidłowy rozwój oka, jednak wciąż jesteśmy daleko od pełnego zrozumienia leżącej u podstaw architektury genetycznej. Profilowanie ekspresji genów w całym genomie jest użytecznym narzędziem do wyjaśnienia sieci regulacji genetycznej rozwoju oka. Jednak niewielki rozmiar zarodkowego oka u rybek zebrafish sprawia, że uzyskanie nienaruszonych i czystych tkanek oka do analizy ekspresji jest trudne. Na przykład długość przednio-tylna oka między 2. a 3. dniem wynosi zaledwie około 200-300 μm, podczas gdy średnica soczewki jest mniejsza niż 100 μm. Ponadto nabłonek barwnowy siatkówki (RPE) znajdujący się pod siatkówką jest tylko nabłonkiem jednowarstwowym. Chociaż profile ekspresji genów można uzyskać z całego zarodka, nie odzwierciedlają one dokładnie ekspresji w tych konkretnych tkankach. Dlatego w celu skutecznego profilowania ekspresji genów w rozwoju oka konieczne jest uzyskanie czystej tkanki. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy metodę mikrodysekcji nienaruszonej siatkówki oraz siatkówki z przytwierdzonym RPE w okresie od 1 do 3 dpf, co obejmuje główne etapy morfogenezy oka. Wszystkie procedury można przeprowadzić przy użyciu precyzyjnych pęset i ogólnego wyposażenia laboratoryjnego pod standardowymi stereomikroskopami. W przypadku dysekcji siatkówki, jednowarstwowy RPE jest usuwany i odrywany poprzez ruch omiatający oraz dzięki preferencyjnej adhezji pozostałości RPE do powierzchni płytki hodowlanej służącej do dysekcji. W przypadku dysekcji siatkówki z przytwierdzonym RPE, adhezja RPE do płytki dysekcyjnej jest usuwana przed przystąpieniem do zabiegu, dzięki czemu RPE może zostać w całości zachowany wraz z siatkówką. Ostrożne uniesienie tej tkanki pozwala na efektywne oddzielenie domniemanej ciała naczyniowej i twardówki. Soczewkę w obu przypadkach można usunąć za pomocą chemicznie trawionej igły wolframowej. Podsumowując, nasza metoda pozwala na uzyskanie nienaruszonych tkanek oka i została z powodzeniem wykorzystana do badania specyficznych dla tkanki profili ekspresji siatkówki rybek zebrafish1, 2i nabłonek barwnowy siatkówki3Empty source HTML. No content to translate.

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Danio pręgowany jest popularnym modelem zwierzęcym w badaniach nad rozwojem oka ze względu na szybki rozwój poza organizmem matki oraz wysoką płodność. Do 3. dnia po...

W niniejszym filmie przedstawiono mikrodysekcję siatkówki oraz siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE) z embrionów danio pręgowanego w pierwszym do trzeciego dnia po zapłodnieniu. Wszystkie procedury można przeprowadzić przy użyciu precyzyjnych pęset i ogólnych materiałów laboratoryjnych. Podczas dysekcji siatkówki pod standardowym mikroskopem stereoskopowym, jednowarstwowy RPE jest usuwany i oddzielany poprzez ruchy zamiatania oraz przyleganie RPE do powierzchni płytki hodowlanej.W przypadku dyssekcji siatkówki przytwierdzonej do RPE, właściwości adhezyjne płytki hodowlanej są usuwane poprzez zmiażdżenie embrionu i przemywanie przed przystąpieniem do dyssekcji. Aby zachować nienaruszoną strukturę RPE, ostrożne uniesienie tej tkanki pozwala na efektywne oddzielenie naczyniówki i twardówki od siatkówki przytwierdzonej do RPE, po czym następuje usunięcie soczewki za pomocą chemicznie trawionej igły wolframowej. Ta metoda dyssekcji pozwala na uzyskanie nienaruszonych tkanek siatkówki i była z sukcesem wykorzystywana do badania tkankowo specyficznej ekspresji RNA oraz profili siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki u danio pręgowanego.Witajcie, nazywam się Li Jang i reprezentuję laboratorium profesora UFE Leona z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Purdue. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przeprowadzić sekcję tkanek embrionalnego oka danio pręgowanego. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania sieci genetycznej regulującej rozwój oka.Zacznijmy zatem. Osiem. Przed mikrodysekcją należy przygotować następujące roztwory: E3, medium, sterylizowany przez filtr roztwór Ringera oraz 5N wodorotlenek sodu.Następnie należy przeprowadzić trawienie chemiczne igieł wolframowych. Umieść mały zlew w szalce Petriego, stabilizując go gliną, aby ułatwić manipulowanie zlewem i zapobiec rozlaniu wodorotlenku sodu. Do boku zlewka przymocuj standardowy spinacz do papieru.Wlej do zlewki pięć normalny wodorotlenku sodu, aż spinacz znajdzie się w kontakcie z wodorotlenkiem sodu. Podłącz ujemną elektrodę z zasilacza prądu stałego do spinacza, a dodatnią elektrodę do jednego końca krótkiego odcinka drutu wolframowego. Owiń drugi koniec drutu wolframowego kulką z gliny o średnicy czterech milimetrów i zanurz ten koniec w roztworze wodorotlenku sodu.Zwiększ napięcie do około trzech woltów i zanurzaj drut w górę i w dół w roztworze wodorotlenku sodu w odstępach jednosekundowych przez około 10 minut. Drut wolframowy wystawiony na działanie wodorotlenku sodu będzie stopniowo cieńszy, gdy kulka gliny odpadnie z drugiej strony drutu przymocowanego do elektrody dodatniej, przyjmując kształt ostrej igły. Przepłucz ostrą igłę roztworem Ringera lub E3, aby usunąć osady soli, a następnie przymocuj igłę do drewnianego aplikatora za pomocą taśmy lub uchwytu do igieł w celu ułatwienia manipulacji podczas przygotowywania embrionów do sekcji.Utrzymuj dorosłe super fish zgodnie ze standardowymi protokołami w noc poprzedzającą rozród. Rozdziel ryby rodzicielskie w statycznych zbiornikach hodowlanych na pary, używając przegrody. Usuń przegrodę następnego dnia rano po zapaleniu światła w pomieszczeniu i pozwól rodzicom na krzyżowanie w 10-minutowych odstępach co pół godziny, rozdzielając ryby po każdym krzyżowaniu.Zaroby z każdego krzyżowania należy utrzymywać oddzielnie w pożywce E3 w temperaturze 28°C. Etap rozwoju embrionów należy określić od 10 do 12 godzin po zapłodnieniu, a następnie ponownie go zweryfikować bezpośrednio przed sekcją w określonych punktach czasowych. Do sekcji należy użyć polistyrenowych płytek hodowlanych Falcon 60 × 15 mm.Nowa, nieużywana płytka wykazuje naturalną właściwość adhezyjną względem tkanki RPE przez około 20 minut, co może ułatwić usuwanie RPE podczas dyssekcji siatkówki. Jeśli pożądane jest pozostawienie siatkówki z przytwierdzonym RPE, właściwość adhezyjną tę można zniwelować poprzez całkowite zmiażdżenie dwóch embrionów w płytce hodowlanej zawierającej roztwór ringera i pozostawienie ich na 30 minut przed dyssekcją, a następnie dokładne przemycie świeżym roztworem ringera przed przystąpieniem do zabiegu. Wszystkie precyzyjne dyssekcje są wykonywane przy powiększeniu od pięciu do ośmiu x przy użyciu mikroskopu Olympus SC X 16 z obiektywem jeden x.Używając pęsety Dumont lub chemicznie trawionej igły wolframowej, należy podgrzać stolik mikroskopu do 28°C. Aby zminimalizować wpływ wahań temperatury przed rozpoczęciem sekcji siatkówki, należy przenieść embrion na określonym etapie rozwoju do 5 mL roztworu Ringera w płytce hodowlanej Falcon 60 × 15 mm, przygotowanej zgodnie z opisem dla sekcji siatkówki bez RRPE. Za pomocą ostrej końcówki pęsety należy szybko odciąć głowę i część przedniego tułowia, usuwając ciało danio pręgowanego. Następnie należy przypiąć tylny koniec sekcji głowy i tułowia do płytki hodowlanej. Pomocniczą pęsetą należy otworzyć głowę od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.Usunąć mózg w taki sposób, aby przyśrodkowa strona oczu została odsłonięta i była skierowana ku górze w celu dalszych manipulacji. Aby wypreparować siatkówkę, użyć końcówki pęsety do ostrożnego omiatania odsłoniętego nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na przyśrodkowej stronie oka skierowanej ku górze, aż do momentu pojawienia się niewielkiego otworu w siatkówce. Kontynuować omiatanie i oddzielanie, aż przyśrodkowa strona siatkówki zostanie niemal całkowicie odsłonięta.Należy unikać zadrapania i przebicia odsłoniętej siatkówki podczas usuwania bocznego RPE z siatkówki oka skierowanego w stronę naczynia hodowlanego. Przyjąć kąt około 45 stopni względem powierzchni płytki hodowlanej i delikatnie przesunąć pęsetą po oku. Usunąć RPE, który jest stosunkowo mocno przytwierdzony do ora serrata, przytwierdzając oddzieloną część RPE do płytki hodowlanej w celu przeprowadzenia sekcji.Następnie delikatnie unieś siatkówkę, aby oczyścić pozostałości RPE i usuń soczewkę, wykorzystując właściwości adhezyjne szalki hodowlanej. Należy uważać, aby nie uszkodzić komórek siatkówki, które również będą lekko przylegać do powierzchni szalki. Jeśli soczewka nie odseparuje się podczas toczenia, użyj trawionej igły wolframowej, wykonując ruch obrotowy na powierzchni soczewki.Aby rozpocząć sekcję siatkówki z przytwierdzonym nabłonkiem barwnikowym (RPE), należy użyć płytki hodowlanej Falcon 60 by 15 mm przygotowanej zgodnie z opisem dla sekcji siatkówki z przytwierdzonym RPE. Przenieść embrion na konkretnym etapie rozwoju do 5 ml roztworu Ringera. Odciąć głowę oraz część przedniej części tułowia.Szybkie usunięcie ciała danio pręgowanego, zgodnie z wcześniejszą procedurą. Przytwierdzenie tylnego końca sekcji głowy i tułowia do płytki hodowlanej. Za pomocą pęsety pomocniczej otwarcie głowy od strony grzbietowej, zaczynając od przedniej części czoła.Usunąć mózg w taki sposób, aby przyśrodkowa strona oczu była odsłonięta i skierowana do góry. W celu dalszych manipulacji pęsetą, delikatnie unieść oko od tylnej strony bocznej i obrócić je w stronę przednią. Tkanka naczyniówki i twardówki znajdująca się na zewnątrz warstwy RPE jest przymocowana stosunkowo ściśle do skóry i można ją w większości oddzielić, ostrożnie obracając oko w stronę przednią.Usuń soczewkę za pomocą igły wolframowej, gdy boczna strona oka zostanie odsłonięta, a oko wciąż pozostaje przytwierdzone do skóry w celu przeprowadzenia sekcji siatkówki. Bez RPE oraz siatkówki z przytwierdzonym RPE, wypreparowane próbki można zebrać w triolu w mikroprobówce do RNA w celu późniejszej charakterystyki RNA.Przedstawiono tutaj udaną dyssekcję siatkówki bez nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE), w której zachowano integralność siatkówki, co wskazuje nienaruszona powierzchnia siatkówki. Odpowiadający jej przekrój histologiczny wykazuje również, że architektura siatkówki jest bardzo dobrze zachowana. W szczególności wyjątkowo dobra jest konserwacja macierzy zewnątrzkomórkowej pomiędzy warstwą fotoreceptorów a RPE.Pomyślna dyssekcja siatkówki z przytwierdzonym RPE objawia się nienaruszoną i ciągłą warstwą RPE. Odpowiadający jej przekrój histologiczny wykazuje, że zarówno komórki siatkówki, jak i komórki RPE są w dobrym stanie. Całkowite RNA wyekstrahowane z dyssekowanych siatkówek charakteryzuje się wysoką jakością.Wskazuje na to elektroforegram oraz obraz żelu uzyskane z analizy bioanalizatorem. Linia bazowa jest płaska, a piki rybosomalne 18 s i 28 s są nienaruszone. Wskaźnik integralności RNA (RNA integrity number) jest zazwyczaj większy niż 9,8.Właśnie zaprezentowaliśmy procedury mikrodyssekcji służące do pozyskiwania siatkówki embrionalnej danio pręgowanego z nabłonkiem barwnikowym siatkówki (RPE) oraz bez niego. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że najbardziej krytycznymi krokami w dyssekcji siatkówki są ruchy zamiatające końcówką pęset oraz rolowanie tkanki. W przypadku usuwania pozostałości RPE zauważyliśmy, że oparcie łokci o regulowane podłokietniki krzesła podczas dyssekcji może znacząco ustabilizować ruchy dłoni.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

microdissection-of-zebrafish-embryonic-eye-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikrodysekcja tkanek oczu zarodkowych rybki Zebro

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Rozwój soczewki wiąże się z interakcjami z innymi tkankami. Kilka mutantów oka u danio pręgowanego charakteryzuje się nienaturalnie małym rozmiarem soczewki. W niniejszym opracowaniu prezentujemy eksperyment z transplantacji soczewki, mający na celu ustalenie, czy fenotyp ten wynika z przyczyn wewnętrznych, czy z wadliwych interakcji z tkankami otaczającymi soczewkę.

Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Ten film opisuje protokół, który został opracowany do analizy soczewek dorosłych i larw danio pręgowanego w celu analizy morfologii soczewki korowej i integralności strukturalnej szwów soczewki.

Rozwarstwienie soczewki oka: technika obserwacji morfologii soczewki danio pręgowanego

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Naucz się mikrodysekcji siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki z embrionów danio pręgowanego w wieku 1–3 dni po zapłodnieniu. Ta metoda pozwala na izolację nienaruszonych tkanek do badań ekspresji RNA.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Przeglądaj więcej filmów