JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:11 min • April 30th, 2023
- Organoidy to małe, trójwymiarowe kultury komórkowe pochodzące z komórek macierzystych specyficznych dla tkanki. Są stabilne genomowo, ale genetycznie modyfikowalne poprzez transfekcję, a zatem idealne do badań genetycznych. Do transfekcji należy umieścić organoidy nasienne na wielodołkowej płytce hodowlanej ze specjalną pożywką hodowlaną i inkubować przez żądany czas. Następnie dodaj mieszaninę dysocjacyjną do płytki, aby pomóc w dysocjacji komórek organoidowych. Przenieś mieszaninę do probówki i odwiruj. Zawiesić osad organoidowy w buforze elektroporacyjnym zawierającym fluorescencyjnie znakowane plazmidowe DNA. Bufor stabilizuje komórki i zapobiega ich śmierci z powodu stresu elektrycznego.
Przenieś mieszaninę do kuwety i elektroporuj ogniwa. Impulsy elektryczne przez błonę komórkową powodują tymczasowe tworzenie się porów, aby ułatwić wchłanianie plazmidowego DNA do komórki. Po elektroporacji natychmiast dodać pożywkę hodowlaną do zawiesiny komórek i przenieść mieszaninę do probówki. Teraz odwiruj komórki. Ponownie zawiesić osad w matrycy piwnicznej i przenieść na płytkę wielodołkową w celu polimeryzacji. Umieść płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i sprawdź fluorescencję w komórkach, co potwierdza skuteczną transfekcję. W poniższym protokole wykonamy elektroporację w celu przetransfekowania organoidów przewodu pokarmowego.
- Zacznij od wstępnego podgrzania 48-dołkowych płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza do wysiewu po elektroporacji, a następnie przygotuj podłoża specyficzne dla kultur podstawowych i organoidowych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Hoduj pięć dołków organoidów na próbkę elektroporacji na 48-dołkowej płytce. Przygotuj 230 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego z 10 mikromolami Y27632 na studzienkę. Monitorować organoidy pod mikroskopem. Usunąć pożywkę hodowlaną ze studzienek i mechanicznie zdysocjować organoidy w przygotowanej mieszaninie dysocjacyjnej. Połącz pięć studzienek na próbkę do elektroporacji w jednej 15-mililitrowej probówce.
Wymieszaj zawartość probówki przez wirowanie i inkubuj ją przez 5 do 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż pojawią się skupiska od 10 do 15 komórek, sprawdzając dysocjację za pomocą mikroskopu. Zatrzymaj trawienie, dodając do 10 mililitrów podłoża podstawowego bez antybiotyków. Odwirować probówkę z prędkością 450 razy g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć ogniwa 4 mililitrami buforu do elektroporacji. Odwirować i wyrzucić supernatant po każdym przemyciu. Po przepłukaniu ponownie zawiesić osad organoidowy w 100 mikrolitrach buforu do elektroporacji z 30 mikrogramami plazmidowego DNA.
Dozuj kompletną mieszaninę DNA-organoid do kuwety do elektroporacji. Upewnij się, że unikasz pęcherzyków powietrza. Ustaw parametry elektroporacji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i postukaj palcem w kuwetę, aby delikatnie wymieszać ogniwa. Umieść kuwetę w komorze kuwety i naciśnij przycisk impedancji na elektroporatorze, aby zanotować wartość impedancji. Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować program elektroporacji i kontrolować wyświetlane wartości prądów, voltage i energie.
Po elektroporacji natychmiast dodać do komórek 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez antybiotyków i wymieszać, pipetując w górę iw dół. Przenieś próbkę do nowej 15-mililitrowej probówki i przepłucz kuwetę podłożem podstawowym, aby zebrać pozostałe komórki, a następnie inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Odwirować komórki w temperaturze 450 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach matrycy podstawowej i wysiać 20 mikrolitrów kropli na wstępnie podgrzanej 48-dołkowej płytce.
Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji i dodać 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej Y27632 i CHIR-99021 do dołka. Aby określić skuteczność transfekcji, sprawdź fluorescencję w kontroli transfekcji pod mikroskopem po 24 do 48 godzinach.