JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:00 min. • April 30th, 2023
- Aktywowane limfocyty T przemieszczają się do mikrośrodowiska guza trzustki, gdzie uwalniają cytokiny, takie jak interferon-gamma lub IFN gamma i czynnik martwicy nowotworu alfa lub TNF alfa, co pomaga pośredniczyć w skutecznej odpowiedzi przeciwnowotworowej. Ponieważ cytokiny szybko przemieszczają się z limfocytów T, poziomy wewnątrzkomórkowe mogą być niewykrywalne. Dlatego limfocyty T wymagają stymulacji w celu zwiększenia podstawowej produkcji cytokin w celu zbadania ich terapeutycznej roli w guzie.
Zacznij od pobrania zawiesiny komórek nowotworowych z trzustki myszy. Teraz potraktuj limfocyty T obecne w zawiesinie komórkowej koktajlem stymulacji cytokin i inkubuj mieszankę przez żądany czas. Koktajl ten ułatwia uwalnianie jonów wapnia z retikulum endoplazmatycznego do cytoplazmy. Wysoki poziom wapnia z kolei aktywuje pewne jądrowe czynniki transkrypcyjne, co prowadzi do wzrostu produkcji cytokin w limfocytach T.
Następnie potraktuj komórki koktajlem inhibitorów transportu białek i inkubuj probówkę. Koktajl ten blokuje transport cytokin z retikulum endoplazmatycznego do kompleksu Golgiego, co powoduje akumulację cytokin w komórce. Na koniec wybarwić komórki za pomocą odpowiednich markerów wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej. W poniższym protokole przeprowadzimy stymulację limfocytów T w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia cytokin.
- Na początek użyj kleszczy, aby przenieść guz na szalkę Petriego. Przechowuj 5 mililitrów pożywki wytrawiającej w 50-mililitrowej tubce na lodzie, aby zapobiec rozpoczęciu aktywności enzymów. Weź małą porcję tego roztworu, aby pokryć guz na szalce Petriego. Użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby pociąć guz na małe kawałki o długości mniej niż 3 milimetry. Zeskrob kawałki guza do probówki i delikatnie odwróć rurkę, aż wszystkie kawałki zostaną zanurzone w pożywce trawiącej. Przenieść probówkę na urządzenie do wytrząsania na 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza do strawienia. Upewnij się, że wszystkie kawałki guza są zanurzone i nie przyklejają się do krawędzi rurki.
Natychmiast po etapie trawienia umieść probówkę na lodzie, aby spowolnić aktywność enzymu. Dodaj EDTA, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 milimoli i krótko zwiruj próbkę do wymieszania w celu dalszego spowolnienia aktywności enzymu. Otwórz probówkę i spłucz wszelkie odpady trawione przez guz z pokrywki probówki świeżym medium RPMI. Następnie przygotuj sitko o średnicy 70 mikronów. Umieść go na 50-mililitrowej otwartej tubie na lodzie. Wstępnie zwilż filtr medium. Ponownie zawiesić strawione komórki i umyć boki probówki za pomocą 25-mililitrowej lub większej paski. Szerszy otwór pasiaka umożliwia łatwe przepuszczanie gęstego trawienia.
Przełóż cały płyn na sitko za pomocą 25-mililitrowej paski. Rozcieraj guz w górę iw dół na górze filtra za pomocą 1-mililitrowego tłoka strzykawki. Ciągle myj komórki przez sitko za pomocą RPMI. Upewnij się, że myjesz z wystarczającą siłą, aby przepchnąć komórki. Kontynuuj mycie, aż wszystkie komórki przejdą przez sitko. Wirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy g i 4 stopnie Celsjusza.
Ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy i pełne RPMI, a następnie przejść bezpośrednio przez inny filtr, aby usunąć wszelką macierz zewnątrzkomórkową lub duże grudki komórek, których nie można odpowiednio zawiesić. Jeśli stymulacja nie jest wymagana, natychmiast wyizolowane komórki należy wybarwić do analizy metodą cytometrii przepływowej lub ponownie zawiesić je w pożywce zamrażającej o stężeniu 10% DMSO w FBS i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Aby wykonać stymulację, najpierw policz komórki. Rozcieńczyć komórki w kompletnym pożywce, aby osiągnąć stężenie 2 razy 10 do 6 na 100 mikrolitrów. Umieścić 100 mikrolitrów komórek w każdym dołku na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Dodać 100 mikrolitrów kompletnej pożywki zawierającej 2X preparat PMA i jonomycyny. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na godzinę. Następnie dodaj 20 mikrolitrów 10-krotnego preparatu Brefeldin-A i Monensin oraz kompletne podłoża, aby uzyskać końcowe stężenie odpowiednio 1,06 mikromola i 2,0 mikromola. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na kolejne cztery godziny.