Pierwotna izolacja komórek groniastych: metoda izolowania komórek groniastych z trzustki myszy

- Komórka groniasta trzustki to komórka zewnątrzwydzielnicza, która zawiera różnorodne enzymy trawienne. Czasami, w odpowiedzi na sygnalizację onkogenną, komórka groniasta przekształca się w komórkę przewodową. Ta komórka przewodowa może później stać się rakowa. Dlatego tak ważne jest, aby wyizolować komórki groniaste w celu zbadania ich roli w progresji raka trzustki.

Zacznij od odizolowania trzustki od myszy poddanej eutanazji. Dodaj trzustkę do łodzi wagowej zawierającej zbilansowany roztwór soli uzupełniony antybiotykiem. Zmiel trzustkę na małe kawałki za pomocą nożyczek i dodaj tkankę trzustki do probówki. Następnie dodaj roztwór kolagenazy do kawałków trzustki w probówce.

Kolagenaza trawi kolagen, który utrzymuje tkankę razem, dzięki czemu tkanka rozpada się na drobne kawałki. Teraz dodaj pożywkę zawierającą surowicę do probówki i umieść tkankę na lodzie. Pomaga to zatrzymać działanie kolagenazy.

Przefiltruj tkankę i pożywkę dwukrotnie, za każdym razem stopniowo zmniejszając rozmiar oczek filtra, aby uzyskać zawiesinę drobnych tkanek. Na koniec odwirować powstałą zawiesinę, aby zebrać komórki groniaste w granulce. Usunąć supernatant i przechowywać komórki groniaste do dalszej analizy. W poniższym protokole wyizolujemy komórki groniaste z trzustki myszy poddanej eutanazji.

- Aby wyciąć trzustkę od myszy poddanej eutanazji, najpierw przypnij łapy myszy do polistyrenowej pokrywy, ustawiając ją tak, aby ogon był skierowany w stronę badacza, a następnie spryskaj brzuch 70% etanolem. Użyj autoklawowanych kleszczy, aby podnieść futro i skórę w linii środkowej, a za pomocą autoklawowanych nożyczek wykonaj nacięcie przez futro i skórę od ujścia cewki moczowej do obszaru przepony i klatki piersiowej. Wykonaj dodatkowe nacięcia w lewo i w prawo, aby odciąć futro i skórę, tworząc wyraźny widok jamy brzusznej.

Następnie wciąć wyściółkę otrzewnej pośrodku, po prawej i lewej stronie i odciągnąć ją od narządów. Użyj kleszczy, aby podnieść jelita i przesunąć je na lewą stronę myszy, tworząc przestrzeń, aby zobaczyć jasnoróżową trzustkę przyczepioną do ciemnoczerwonej owalnej śledziony. Tkanka trzustki będzie miała miękką, gąbczastą teksturę. Wytnij trzustkę, która biegnie wzdłuż żołądka, przeplatając się z jelitami.

Oddziel śledzionę od trzustki i umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów HBSS z 1X penicyliną-streptomycyną i przenieś ją do okapu z przepływem laminarnym. Wlej zawartość probówki do pustej łódki do ważenia i za pomocą kleszczy umyj trzustkę, obracając ją. Następnie za pomocą kleszczy przenieś trzustkę do drugiej łodzi ważącej zawierającej HBSS z penicyliną-streptomycyną i ponownie umyj przez wirowanie.

Przenieść trzustkę do trzeciej łodzi wagowej zawierającej HBSS z penicyliną-streptomycyną i rozpocząć krojenie trzustki na 5-milimetrowe lub mniejsze kawałki. Aby wlać zawartość łodzi do ważenia do świeżej 50-mililitrowej probówki, najpierw użyj kleszczy, aby przesunąć kawałki trzustki do płynu podczas przechylania łodzi. Gdy elementy nie są już przymocowane do łodzi, wlej jej zawartość do tuby. Zbierz wszelkie pozostałe kawałki za pomocą kleszczy i umyj kleszcze w probówce.

Po odwirowaniu probówki pod ciśnieniem 931 razy większym niż grawitacja w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie minuty, użyj pipety o pojemności 5 mililitrów, aby usunąć HBSS i pływający tłuszcz. Dodaj 5 mililitrów kolagenazy rozcieńczonej w HBSS. Zamknij probówkę i upewnij się, że jest szczelna pokrywka, owijając rurkę plastikową folią parafinową. Umieść go w inkubatorze, wstrząsając z prędkością 220 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, co da mętny roztwór i kilka pozostałych kawałków tkanki.

Aby zatrzymać dysocjację, umieść probówkę na lodzie i dodaj 5 mililitrów zimnego HBSS z 5% FBS. Po odwirowaniu w 931-krotności grawitacji w 4 stopniach Celsjusza przez dwie minuty, usuń supernatant za pomocą 5-mililitrowej pipety. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach HBSS z 5% FBS i ponownie odwirować przy 931-krotności grawitacji przez dwie minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 5 mililitrów i powtórzyć ten krok z kolejnymi 10 mililitrami HBSS z 5% FBS. Następnie ponownie zawieś granulat w 5 mililitrach HBSS z 5% FBS. Użyj pipety P1000, aby przefiltrować zawiesinę komórek po 1 mililitrze na raz przez siatkę 500 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki.

Aby przepłukać pozostałe komórki trzustki przez siatkę, dodaj dodatkowe 5 mililitrów HBSS z 5% FBS. Następnie użyj pipety P1000, aby przepuścić ten filtrat po 1 mililitrze na raz przez siatkę 105 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Delikatnie odpipetuj tę zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki zawierającej HBSS z 30% FBS, która utworzy warstwę zawiesiny komórek u góry.

Odwirować tę zawiesinę komórkową w temperaturze 233 razy większej od grawitacji w 4 stopniach Celsjusza przez dwie minuty i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad zawierający komórki groniaste w kompletnym podłożu 1X Waymouth.