Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

- Komórki wysp trzustkowych w trzustce wytwarzają niezbędne hormony biorące udział w funkcjach hormonalnych. Aby wyizolować wysepki, najpierw zabezpiecz mysz poddaną eutanazji i chirurgicznie odsłonij jej jamę brzuszną. Odsuń na bok wątrobę i jelita, aby zlokalizować i zacisnąć wspólny przewód żółciowy. Zidentyfikuj bańkę Vater, przewód utworzony przez połączenie trzustki i wspólnych dróg żółciowych.

Następnie wstrzyknąć roztwór enzymu kolagenazy do wspólnego przewodu żółciowego. Przepływ zwrotny z przewodu skutecznie napompowuje trzustkę, ułatwiając indukowaną kolagenazą dysocjację tkanek trzustki. Wyciąć trzustkę do probówki zawierającej więcej roztworu kolagenazy. Mechanicznie posiekaj tkankę i inkubuj, aby wspomóc trawienie tkanek przez kolagenazę.

Po uzyskaniu jednorodnej zawiesiny należy zatrzymać trawienie enzymatyczne poprzez dodanie roztworu zawierającego białka hamujące aktywność kolagenazy. Odwirować w celu zebrania osadu tkankowego. Ponownie zawiesić osad w podłożu o gradiencie o odpowiedniej gęstości, nałożyć na niego odpowiedni bufor i odwirować w celu wytworzenia warstw gradientowych.

Zebrać wysepki z warstwy utworzonej między ośrodkiem gradientu gęstości a buforem. Na koniec wybierz zdrowe wysepki do hodowli. W poniższym protokole zademonstrujemy izolację mysich wysp trzustkowych przez podanie kolagenazy, a następnie wirowanie w gradiacji gęstości.

- Zacznij od przyklejenia kończyn myszy w pozycji leżącej na plecach i spryskania ciała 70% etanolem. Za pomocą kleszczy ze szkła nakrywkowego i zakrzywionych nożyczek chirurgicznych wykonaj około 3-centymetrowe poziome nacięcie skóry brzucha i rozciągnij skórę, aby odsłonić ścianę brzucha. Wykonaj pionowe nacięcie o długości od 3 do 4 centymetrów na otrzewnej brzusznej, aby całkowicie odsłonić trzustkę, i umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.

Popchnij płat wątroby wyżej, aby odsłonić przewód żółciowy, który wygląda jak blada, różowa rurka, i delikatnie przesuń jelita z prawej okolicy lędźwiowej i biodrowej na prawo od jamy brzusznej, aby odsłonić przewód żółciowy i tętnicę wątrobową. Użyj Schwartz Micro Serrefines, aby ostrożnie zacisnąć wspólny przewód żółciowy jak najbliżej wątroby i zidentyfikować bańkę Vatera, która znajduje się na brodawce dwunastnicy i jest utworzona przez połączenie przewodu trzustkowego i przewodu żółciowego wspólnego.

Używając kleszczyków Micro Adson, aby naciągnąć wspólny przewód żółciowy, włóż półcalową igłę o rozmiarze 30 rozmiarów przymocowaną do 3-mililitrowej strzykawki zawierającej 3 mililitry świeżo przygotowanego roztworu kolagenazy P do bańki Vatera, wciskając igłę do przewodu równolegle do naczynia przez około jedną czwartą długości naczynia. Po umieszczeniu igły na miejscu ustabilizuj igłę za pomocą kleszczyków Micro Adson i powoli i równomiernie wstrzyknij 3 mililitry roztworu kolagenazy P do kanału. Wstrzyknięcie uważa się za udane, jeśli okolice głowy, szyi, tułowia i ogona trzustki są całkowicie napompowane.

- Prawidłowe wejście do bańki i kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego mają kluczowe znaczenie dla udanych zbiorów trawiennych. Przebijanie ścianek kanałów zmniejsza skuteczność izolacji.

- Za pomocą zakrzywionych kleszczy i kleszczy Micro Adson ostrożnie wyciągnij napompowaną trzustkę, zaczynając od śledziony i kontynuując w kierunku żołądka i wzdłuż dwunastnicy. Następnie umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce do wytrawiania zawierającej 3 mililitry lodowatego roztworu kolagenazy P. Aby zebrać wysepki, najpierw użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby posiekać trzustkę przez 3 do 5 sekund, a następnie umieść rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością od 100 do 120 obrotów na minutę przez 12 do 13 minut.

Pod koniec inkubacji delikatnie potrząsaj probówką przez około 30 sekund, aby rozbić tkankę, aż roztwór stanie się jednorodny, co potwierdzają drobne, przypominające piasek cząstki tkanki trzustki. Jak tylko tkanka zostanie strawiona, umieść probówkę na lodzie i dodaj 40 mililitrów lodowatego roztworu, aby zakończyć reakcję enzymatyczną. Po delikatnym rozbiciu osadu odwiruj tkankę trawienną w wirówce z wahadłowym wiadrem, a następnie wykonaj dwa wirowania z 20 mililitrami świeżego roztworu zatrzymującego na mycie.

Po ostatnim praniu ponownie zawiesić granulat w 40 mililitrach lodowatego HBSS na trzy dodatkowe prania, ponownie zawieszając granulat w 5 mililitrach roztworu gradientu gęstości w temperaturze pokojowej po ostatnim praniu. Krótko zmieszaj probówkę z niską prędkością, aż roztwór zostanie zhomogenizowany, a następnie dodaj do probówki kolejne 5 mililitrów gradientu gęstości w temperaturze pokojowej. Teraz użyj 10-milimetrowej pipety, aby delikatnie i powoli dodać 10 milimetrów HBSS o temperaturze pokojowej do probówki w sposób kroplowy, aby umożliwić utworzenie gradientu, i użyj wahadłowej wirówki kubełkowej, aby wyizolować populacje komórek przez separację gradientu gęstości.

Pod koniec wirowania użyj 10-mililitrowej pipety, wstępnie zwilżonej zimnym HBSS, aby zebrać od 5 do 10 mililitrów warstwy wysepek między gradientem gęstości a HBSS. Przenieś wysepki do nowej 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów świeżego, lodowatego HBSS i zbierz komórki przez odwirowanie w wirówce z wahadłowym wiadrem. Ostrożnie zassać wszystkie oprócz ostatnich 3 mililitrów supernatantu, nie naruszając osadu, i umyć wysepki jeszcze co najmniej trzy razy za pomocą 20 mililitrów świeżego HBSS na pranie.

Po ostatnim praniu zastąp supernatant 4 mililitrami pożywki RPMI 1640 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie zakręć rurką, aby usunąć osad. Natychmiast wlej wysepki do 100-milimetrowej szalki Petriego i umyj rurkę 5 mililitrami świeżej pożywki RPMI 1640, aby zebrać wszelkie pozostałe wysepki, łącząc płukanie z innymi wysepkami.

Następnie użyj mikroskopu preparacyjnego i końcówki do pipet o pojemności 20 mikrolitrów, aby wybrać zdrowe kuliste lub podłużne, złotobrązowe wysepki o gładkiej powierzchni z szalki Petriego w celu przeniesienia na nową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów kompletnej pożywki RPMI 1640. Po zebraniu wszystkich wysepek umieść je w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym powietrzu na noc.