Barwienie immunofluorescencyjne sferoid: technika analizy sferoid pod kątem ekspresji wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej ekspresji antygenu

- Sferoidy to trójwymiarowe modele hodowli komórkowych in vitro. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego najpierw wygeneruj hodowlę sferoidalną wymaganego typu komórek na płytce wielodołkowej. Za pomocą mikropipety z końcówką z szerokim otworem zbierz sferoidy, uważając, aby nie pękły z powodu sił ścinających.

Następnie utrwal i prześledź sferoidy, aby poszczególne komórki były przepuszczalne. Teraz inkubuj z roztworem zawierającym białka, aby zablokować niespecyficzne miejsca interakcji białkowych na powierzchni komórki. Potraktuj sferoidy pożądanym koktajlem przeciwciał pierwotnych. Inkubuj, aby przeciwciała związały się z cząsteczkami docelowymi na powierzchni komórki.

Następnie oznacz sferoidy fluorescencyjnie znakowanym roztworem przeciwciał drugorzędowych specyficznym dla przeciwciał pierwszorzędowych. Na koniec potraktuj sferoidy odpowiednim fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA, aby wybarwić jądra komórkowe. Za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu fluorescencyjnego zobrazuj wiele przekrojów optycznych sferoidy w różnych płaszczyznach optycznych.

Uchwycone obrazy odzwierciedlają znakowane fluorescencyjnie jądra i antygeny będące przedmiotem zainteresowania. Połącz stosy za pomocą odpowiedniego oprogramowania, aby uzyskać ostateczny złożony obraz sferoidy 3D. W poniższym protokole przeprowadzimy barwienie immunofluorescencyjne sferoidów fibroblastów trzustki i fibroblastów związanych z rakiem hodowanych w obecności stymulanta, TGF beta 1.

- Najpierw odetnij koniec końcówki pipety, aby powiększyć otwór. Po zakończeniu inkubacji użyj tej wyciętej końcówki pipety, aby zebrać sferoidy do jednej 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej, według warunków eksperymentalnych lub dla białka, które ma być analizowane. Odwirować sferoidy z prędkością 1000 g przez około 30 do 60 sekund. Ostrożnie usunąć sklarowany sklarant zawierający metylocelulozę za pomocą pipetowania, uważając, aby nie naruszyć granulowanych sferoidów.

- Należy zachować szczególną ostrożność podczas przenoszenia sferoid do probówek reakcyjnych. Upewnij się, że nie masz sił naprężeń ścinających, przecinając końcówkę. Ważne jest również, aby zebrać wszystkie sferoidy. Na etapie prania upewnij się, że nie zgubiłeś sferoid przez aspirację.

- Aby umyć sferoidy w 50 mikrolitrach 1X PBS, odwirować przy 1,000 razy g przez 30 do 60 sekund, a następnie ostrożnie usunąć PBS przez pipetowanie. W zależności od białka, które ma być barwione, utrwal sferoidy za pomocą 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Przemyć sferoidy PBS, jak opisano wcześniej. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton X w PBS przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie umyj sferoidy w PBS trzy razy, jak opisano wcześniej. Dodać PBS zawierający 5% FBS i 2% BSA do sferoid i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w celu zablokowania niespecyficznych miejsc interakcji białek.

Teraz inkubuj sferoidy z 30 mikrolitrami przeciwciał pierwszorzędowych w PBS z 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj sferoidy w PBS trzy razy, jak opisano wcześniej.

Następnie inkubować sferoidy z 30 mikrolitrami przeciwciał drugorzędowych w PBS z 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Umyj sferoidy w PBS trzy razy, jak opisano wcześniej.

Następnie inkubuj komórki z 30 mikrolitrami roztworu barwiącego DAPI przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Umyj sferoidy w PBS jeden raz, jak opisano wcześniej. Za pomocą szklanej pipety Pasteura umieść sferoidy na szkiełku podstawowym w kropli PBS. Użyj laserowego mikroskopu skaningowego, aby zobrazować sferoidy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w powiększeniu 10 razy. Weź różny przekrój optyczny sferoidy w różnych płaszczyznach optycznych stosu Z.