JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:41 min. • April 30th, 2023
- W magnetycznych, biodrukowanych kokulturach 3D wiele typów komórek tworzy struktury 3D lub sferoidy pod wpływem pól magnetycznych. Aby założyć hodowlę, najpierw przygotuj jednokomórkowe zawiesiny komórek rakowych i fibroblastów w odpowiednim pożywce. Następnie dodaj biokompatybilne nanocząstki magnetyczne do obu zawiesin. Nanomateriały te zawierają dodatnio naładowane reszty poli-L-lizyny, które ułatwiają niespecyficzne wiązanie cząstek magnetycznych z błoną komórkową poprzez oddziaływania elektrostatyczne.
Inkubuj, aby osiągnąć maksymalne namagnesowanie komórek rakowych i fibroblastów. Następnie wymieszaj obie zawiesiny komórkowe w pożądanym stosunku. Przenieś tę zawiesinę nanocząstek komórkowych na płytkę hodowlaną odpychającą komórki, specjalnie zoptymalizowaną, aby zapobiec przyczepianiu się komórek. Zamontuj tę konfigurację na napędzie magnetycznym i inkubuj. Siły magnetyczne kierują agregacją lub biodrukowaniem namagnesowanych komórek rakowych i fibroblastów w sferoidalne struktury 3D na dnie studni.
Gdy uformują się sferoidy, usuń magnes i pozwól kokulturom 3D urosnąć do pożądanej objętości. W tym protokole zademonstrujemy generowanie trójwymiarowych sferoid kokulturowych z komórek raka trzustki i komórek fibroblastów trzustki aktywowanych PS1 przy użyciu techniki biodruku magnetycznego.
Stosując standardową technikę aseptycznej hodowli tkankowej, posadź interesujące nas komórki rakowe i fibroblasty w kolbach T75 w odpowiedniej pożywce wzrostowej. Gdy komórki osiągną zbieżność od 70% do 80%, przemyj kultury jeden raz w 5 mililitrach PBS i odłącz komórki od powierzchni kolby za pomocą 2 mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA na kolbę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po potwierdzeniu oderwania pod mikroskopem, dezaktywuj trypsynę za pomocą 8 mililitrów pożywki wzrostowej na kolbę. I odpipetuj komórki kilka razy, aby wygenerować zawiesiny pojedynczych komórek do zliczenia. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w stężeniach 1 razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w świeżej pożywce wzrostowej.
Aby namagnesować komórki, dodaj 10 mikrolitrów NanoShuttle w pożywce wzrostowej na 100 mikrolitrów komórek i delikatnie mieszaj roztwory. Delikatnie odwróć probówki kilka razy i przenieś mieszanki komórkowo-NanoShuttle do pojedynczych dołków na 24-dołkowej płytce. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, delikatnie potrząsając, aby ułatwić wiązanie NanoShuttle z powierzchnią komórki. Pod koniec inkubacji wiązania delikatnie wymieszaj każdą namagnesowaną zawiesinę komórek za pomocą pipetowania i dostosuj stężenie do 1,5 razy 10 do czwartej namagnesowanej komórki rakowe lub fibroblasty na 150 mikrolitrów pożywki.
Wymieszaj fibroblasty i komórki rakowe w stosunku 2 do 1, aby uzyskać łącznie 150 mikrolitrów wysianych komórek na studzienkę. Umieść odpychającą komórki, 96-dołkową płytkę na 96-dołkowym magnetycznym napędzie sferoidalnym z cieńszymi magnesami i umieść 150 mikrolitrów mieszaniny komórek w każdym dołku. Gdy wszystkie komórki zostaną posiaczone, inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 z nadal podłączonym magnetycznym napędem sferoidalnym. Następnego ranka usuń napęd magnetyczny i włóż komórki z powrotem do inkubatora na okres do siedmiu dni.