Test strumienia zewnątrzkomórkowego w sferoidach 3D: metoda pomiaru aktywności metabolicznej sferoid guza trzustki

- Komórki raka trzustki oddziałują z fibroblastami związanymi z rakiem w mikrośrodowisku guza lub TME. Interakcje te modulują aktywność metaboliczną komórek nowotworowych i wpływają na progresję raka.

Sferoidy to agregaty komórkowe, które rekapitulują TME in vitro. Dlatego możemy użyć tych sferoid do przetestowania zmian w funkcjach metabolicznych guza za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ten test mierzy zewnątrzkomórkowe stężenie tlenu i protonów w celu określenia odpowiednio metabolizmu tlenowego i glikolitycznego.

Zacznij od pobrania odpowiednio dobranych sferoid 3D wykonanych przez jednoczesną hodowlę komórek raka trzustki z fibroblastami trzustki. Teraz przenieś sferoidy na płytkę do analizy strumienia i przykryj ją wkładem czujnika zawierającym badane leki. Uruchom test w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego

.

Analizator strumienia pneumatycznie wstrzykuje badane leki z wkładu czujnika na płytkę analityczną w określonych punktach czasowych. W odpowiedzi na testowane leki, komórki uwalniają protony i tlen do mikrokomory płytki, a fluorofory obecne w sondzie czujnika mierzą te poziomy. Na koniec, za pomocą odpowiedniego oprogramowania, przeanalizuj funkcjonalność sferoid.

W poniższym protokole zademonstrujemy metodę pomiaru funkcji metabolicznej komórek nowotworowych trzustki obecnych w sferoidach 3D za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego.

Dzień przed testem metabolicznym należy uwodnić wkład sondy w 200 mikrolitrach kalibru testu na studzienkę na dostarczonej płytce użytkowej i inkubować płytkę użytkową przez noc w nawilżonym inkubatorze bez CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka obserwuj sferoidy na płytce wzrostowej pod mikroskopem świetlnym, aby sprawdzić ich morfologię i ogólną jednorodność. Przenieś płytkę wzrostową na magnetyczny napęd przytrzymujący i ostrożnie zassaj około 120 mikrolitrów podłoża wzrostowego na studzienkę.

Delikatnie umyj sferoidy 120 mikrolitrami podgrzanej pożywki testowej trzy razy. Po ostatnim płukaniu ponownie sprawdź sferoidy pod mikroskopem, aby potwierdzić, że sferoidy nie zostały wypłukane i dodaj 180 mikrolitrów ciepłej pożywki testowej do każdej studzienki.

Użyj końcówki z szerokim otworem, aby ostrożnie zassać pojedynczy, wstępnie umyty sferoid z płytki wzrostu odstraszającej komórki i delikatnie przenieś sferoidę bezpośrednio do środka jednej studzienki sferoidalnej płytki testowej, pozwalając sferoidzie wpaść grawitacyjnie do centralnej mikrokomory studzienki.

Po przeniesieniu wszystkich sferoid umieść płytkę testową w inkubatorze z nawilżanym powietrzem o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez CO2 na jedną godzinę. Podczas inkubacji ustaw wkład czujnika tak, aby rzędy od A do H znajdowały się po lewej stronie i umieść prowadnicę ładowania na górze wkładu tak, aby litera odpowiadająca portowi, który ma być załadowany, znajdowała się w lewym górnym rogu.

Jeśli blacha została równomiernie załadowana, otwórz oprogramowanie analityczne i kliknij opcję Szablony. Kliknij dwukrotnie Pusty szablon i kliknij Generuj grupy. Na karcie Mapa płyt przypisz grupy do płytki testowej odpowiadającej projektowi doświadczalnemu i wybierz cztery dołki narożne jako studzienki tła.

Na karcie Instrument Protocol (Protokół przyrządu) zaznacz opcje Calibrate, Equilibrate (Kalibracja, równowaga) i Baseline Measurements Cycle (Cykl pomiarów linii bazowej). Kliknij opcję Injections (Wtryski) i zdefiniuj związek dla każdego portu. Zmień cykle pomiarowe na 6. Przejrzyj podsumowanie protokołu i grupy, a następnie zapisz szablon projektu testu.

Opierając się na projekcie testu jako wskazówce, użyj pipety wielokanałowej, aby dozować każdy odczynnik bezpośrednio do portów iniekcyjnych, przytrzymując prowadnice ładowania na miejscu opuszkami palców. Po załadowaniu wszystkich odczynników wyjmij prowadnicę ładowania i przytrzymaj wkład na wysokości oczu, aby wizualnie sprawdzić porty iniekcyjne pod kątem równomiernego ładowania.

Przenieś wkład i tabliczkę użytkową do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i rozpocznij kalibrację przed testem. Po kalibracji zastąp płytkę użytkową wstępnie podgrzaną płytką testową zawierającą sferoidy 3D i rozpocznij test. Po zakończeniu testu wyeksportuj dane do odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.