JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:08 min. • April 30th, 2023
- Komórki nowotworowe wykazujące ekspresję białka zielonej fluorescencji lub GFP umożliwiają monitorowanie wzrostu guza i przerzutów za pomocą nieinwazyjnego obrazowania optycznego. Zazwyczaj wszczepiamy te komórki do modelu ortotopowego, który pozwala na odtworzenie mikrośrodowiska guza i naśladuje interakcję komórek nowotworowych z ich otoczeniem.
Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na ciepłej poduszce grzewczej. Teraz włóż nos do maski na nos, aby dostarczyć tlen i izofluran, środek znieczulający. Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie i przetnij tkankę. Delikatnie wyciągnij śledzionę wraz z trzustką i zlokalizuj ogon trzustki.
Załadować strzykawkę z zawiesiną fluorescencyjnych komórek rakowych i delikatnie wstrzyknąć ją do ogona trzustki. W miejscu wstrzyknięcia pojawia się powierzchowny pęcherzyk, potwierdzający udaną implantację. Umieść narządy z powrotem w jamie ciała i użyj sterylnego szwu, aby zamknąć nacięcie. Teraz umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją aż do wyzdrowienia.
Po upływie żądanego czasu umieść mysz w komorze obrazowania i zrób zdjęcia. Wiązka światła uderza w komórki rakowe i wzbudza GFP, który z kolei wytwarza zieloną fluorescencję. W poniższym protokole wykonamy chirurgiczną implantację komórek raka trzustki wykazujących ekspresję GFP w ortotopowym mysim modelu myszy.
Aby wszczepić komórki, najpierw nałóż maść na znieczulone oczy myszy i umieść zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej sterylną serwetką. Następnie delikatnie zdezynfekuj bok zwierzęcia za pomocą trzech peelingów jodowych, a następnie trzykrotnie przepłucz go 70% etanolem. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, załaduj około 200 mikrolitrów przygotowanych komórek do wstępnie schłodzonej strzykawki o pojemności 1 mililitra TB wyposażonej w igłę o rozmiarze 18.
Zamień igłę o rozmiarze 18 na igłę o rozmiarze 27 i umieść komórki z powrotem na lodzie. Następnie zlokalizuj ogólny obszar śledziony w lewym górnym kwadrancie brzucha. Za pomocą kleszczy uszczypnij skórę nad śledzioną i wykonaj około 1-centymetrowe nacięcie, aby utworzyć kieszonkę. Następnie uszczypnij mięśnie gładkie na szczycie śledziony i przetnij tkankę, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.
Następnie delikatnie chwyć ogonowy koniec śledziony i wyciągnij go z jamy ciała. Za pomocą mokrego sterylnego wacika rozprowadź trzustkę przymocowaną do końca śledziony, aby zlokalizować ogon trzustki. Dostarcz 50 mikrolitrów komórek do ogona trzustki. Następnie powoli wykręć igłę z trzustki.
Udana implantacja będzie wyglądała jak powierzchowna bańka bez żadnych przecieków. Przywróć narządy do jamy otrzewnej i zamknij wszystko mięśniami i skórą. Następnie użyj szwu 6-0, aby zamknąć nacięcie. Następnie wstrzyknij zwierzętom ketoprofen i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym użyj komercyjnego systemu obrazowania małych zwierząt, aby zobrazować wzrost guza u żywego zwierzęcia pod narkozą i wybierz odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji.
Następnie uzyskaj początkowy obraz przy użyciu samego światła białego. Trzymając zwierzę w tej samej pozycji, przełącz się na filtry GFP i uzyskaj drugi obraz. Aby przeanalizować wzrost guza, nałóż na siebie obrazy białe i fluorescencyjne, aby ocenić obszar fluorescencyjny i intensywność komórek nowotworowych.