JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:14 min • April 30th, 2023
- Komórki macierzyste raka trzustki lub CSC są podzbiorem samoodnawialnych komórek nowotworowych i mogą dać początek całemu guzowi. CSC znajdują się w dobrze chronionej niszy składającej się z innych komórek, takich jak fibroblasty, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak cytokiny i czynniki wzrostu. Interakcje zachodzące między komórkami w takim środowisku pomagają CSC rozprzestrzeniać się i zwiększać wzrost guza.
Aby zbadać właściwości CSC, izolujemy je od guzów trzustki. Zacznij od pobrania zawiesiny komórkowej z ludzkiej tkanki guza trzustki w pożywce wzrostowej CSC. Następnie wysiewaj zawiesinę, składającą się głównie z fibroblastów i CSC, na płytce pokrytej żelatyną i inkubuj ją przez żądany czas. Fibroblasty przylegają do powierzchni żelatyny, pozostawiając swobodnie unoszące się CSC w zawiesinie komórki.
Weź niewielką ilość zawiesiny komórkowej i dodaj błękit trypanowy. Odpipetować tę mieszaninę do hemocytometru i policzyć liczbę żywotnych komórek. Błękit trypanowy dostaje się do martwych komórek i barwi je na niebiesko, pozostawiając żywe komórki bezbarwne. Na koniec przechowuj CSC do dalszej analizy.
W poniższym protokole wyizolujemy CSC z guzów trzustki.
- Aby wyizolować rakowe komórki macierzyste z gruczolakoraka przewodowego trzustki w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj sterylnego skalpela i kleszczy, aby zmielić ludzki guz w naczyniu hodowlanym o wymiarach 60 x 15 milimetrów zawierającym jeden mililitr sterylnego PBS, dodając kolejne trzy do czterech mililitrów PBS w razie potrzeby, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana.
Przenieść zawiesinę tkankową do sterylnej stożkowej probówki i dodać PBS do końcowej objętości pięciu mililitrów. Następnie mechanicznie homogenizować próbkę za pomocą dysocjatora, odwirować i trawić homogenizowaną tkankę kolagenazą w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po godzinie odwirować komórki, ponownie zawieszając osad w 10 mililitrach kompletnego podłoża. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i ponownie odwiruj komórki, tym razem ponownie zawieszając osad w pięciu mililitrach ACK.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej usuń bufor do lizy czerwonych krwinek przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w pożywce z rakowych komórek macierzystych. Następnie inkubuj komórki na naczyniu pokrytym żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć większość szybko przyczepiających się komórek fibroblastów. Po godzinie odzyskaj supernatant i określ ilościowo liczbę żywotnych komórek raka trzustki.