JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:24 min • April 30th, 2023
- Zwój korzenia grzbietowego lub DRG to neurony czuciowe, które przekazują wiadomości z obwodu do ośrodkowego układu nerwowego. Natomiast neurony splotu mięśniowo-jelitowego biorą udział w ruchach perystaltycznych jelit.
W stanach nowotworowych, takich jak rak trzustki, neurony te zmieniają się morfologicznie i funkcjonalnie. Aby zbadać zmiany morfologii neuronów, należy wysiać komórki nerwowe na szkiełkach nakrywkowych wstępnie pokrytych białkiem lamininy, umieszczonych na płytce wielodołkowej i przykryć komórki podstawowym podłożem nerwowym.
Białko laminy sprzyja wzrostowi neurytów. Inkubuj komórki przez noc. Następnie dodaj pożywkę z ekstraktem z tkanki raka trzustki do pierwszych trzech dołków i pożywkę z ekstraktem zdrowej tkanki trzustki do kolejnych trzech dołków. Inkubuj płytkę. Teraz wykonaj barwienie immunohistochemiczne przy użyciu markerów przeciwciał specyficznych dla neuronów, które wiążą się z neuronami. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym i umieść szkiełko pod mikroskopem odwróconym. Zmierz gęstość neurytów za pomocą oprogramowania.
Neurony DRG hodowane w ekstrakcie z tkanki raka trzustki zwykle wykazują większą gęstość neurytów niż w zdrowym ekstrakcie z tkanki trzustki. Natomiast neurony splotu mięśniowo-jelitowego tworzą dłuższe neuryty niż w zdrowych ekstraktach tkanki trzustkowej. W poniższym protokole przeprowadzimy test neuroplastyczności in vitro na neuronach DRG i splotu mięśniowego nowonarodzonej myszy.
- Aby przygotować komórki do hodowli, użyj hemocytometru, aby oszacować całkowitą liczbę neuronów i gleju. Następnie wysiewaj komórki na 13-milimetrowych, wstępnie powlekanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce. Zastosowana powłoka zależy od celów eksperymentalnych. Następnie przykryj dołki podstawowym podłożem neuronowym i pozwól komórkom przyczepić się do dołków przez noc. Następnego dnia rozmrozić pożywkę uzupełnioną ekstraktem tkankowym lub pożywkę uzupełnioną supernatantem linii komórkowej.
Następnie należy odessać podłoże wysiewające z DRG i wykonać opcjonalne, bardzo delikatne płukanie PBS. Następnie powoli pipetuj pożywkę uzupełnioną ekstraktem tkankowym lub pożywkę uzupełnioną supernatantem linii komórkowej na komórki, aby uzyskać 100 mikrogramów na mililitr. Teraz pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ekstrakcie tkankowym lub pożywce dostarczonej przez supernatant linii komórkowej. Po 48 godzinach odessać pożywkę i utrwalić w 4% paraformaldehydzie w celu barwienia immunologicznego.
W przypadku podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego należy użyć markerów specyficznych dla neuronów i gleju. Do morfometrii należy użyć mikroskopu światła odwróconego wyposażonego w kamerę CCD w połączeniu ze zautomatyzowanym oprogramowaniem do pomiaru gęstości neurytów. Korzystając z 200-krotnego powiększenia, zmierz gęstość neurytów w kulturach neuronalnych, nakładając siatkę 50 x 50 mikronów i licząc gęstość włókien na kwadrat, mierzoną w przecinających się włóknach. Powtórz tę analizę dla czterech różnych regionów najgęstszego wzrostu na czterech do pięciu reprezentatywnych mikrofotografiach na każdym szkiełku nakrywkowym.
Zmierz rozrost neurytów, średnią liczbę gałęzi na neuron, średnią długość gałęzi i rozmiar okołokarionowy z 30 losowo wybranych pojedynczych neuronów z każdego szkiełka nakrywkowego, oznaczając neuryty i perikarya.