Monitorowanie mikrośrodowiska guza na podstawie PTM: metoda śledzenia zmian sztywności ECM za pomocą sferoid guza

- W inwazji guza obwodowe komórki nowotworowe przechodzą przejście nabłonkowe do mezenchymalnego lub EMT, co powoduje miejscową degradację macierzy zewnątrzkomórkowej lub ECM. Możemy badać interakcję komórek nowotworowych z ECM in vitro.

W celu zbadania tych interakcji należy przenieść wstępnie uformowaną sferoidę pochodzącą z komórek nowotworowych trzustki na płytkę zawierającą rusztowanie kolagenowe wraz z osadzonymi fluorescencyjnymi sondami znacznikowymi i pożywką hodowlaną. Sferoida guza uwalnia proteazy, które degradują kolagen i zmniejszają sztywność ECM, co powoduje swobodny ruch sond znacznikowych w ECM.

Inkubować płytkę przez żądany czas. Obserwuj próbkę pod mikroskopem świetlnym, aby spojrzeć na siatkę punktów próbek w rusztowaniu kolagenowym i nagrać z nich dane wideo. Obszar macierzy w pobliżu sferoidy wykazuje maksymalną degradację kolagenu. W związku z tym zwiększył ruch sondy. Natomiast obszar oddalony od sferoidy wykazuje mniejszą degradację kolagenu, co skutkuje ograniczonym ruchem cząsteczek sondy.

Ta technika badania właściwości reologicznych ECM poprzez pomiar trajektorii cząstek znacznikowych jest znana jako mikroreologia śledzenia cząstek lub PTM. W poniższym protokole przeprowadzimy test tworzenia kuli w celu identyfikacji komórek macierzystych raka trzustki i oceny wpływu metforminy.

Na początek przygotuj stację roboczą w okapie z przepływem laminarnym z dwiema 2-mililitrowymi fiolkami. Fiolka 1 będzie zawierała sferoidę guza, a fiolka 2 będzie kontrolą bezkomórkową. Przygotuj rozcieńczoną mieszaninę fluorescencyjnych sond znacznikowych modyfikowanych karboksylanem o średnicy 1 mikrona, dodając 2 części standardowych sond do 25 części sterylnej wody.

Wyjmij z lodówki butelkę 3,1 miligrama na mililitr kolagenu bydlęcego i umieść ją na lodzie. Podajcie 125 mikrolitrów kolagenu, a następnie 50 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu sondy znakującej do fiolki 1. Krótko zawiruj, aby rozprowadzić sondy.

Następnie dodać 235 mikrolitrów odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych zawierających czerwień fenolową o całkowitej objętości 410 mikrolitrów i krótko odwirować przed usunięciem 205 mikrolitrów i umieszczeniem w fiolce 2. Następnie dodaj około 2 mikrolitry 1 molowego wodorotlenku sodu do fiolki 1, aby przywrócić roztwór do neutralnego pH. Krótko zmieszaj, aby wymieszać. Następnie natychmiast wróć do stojaka na lód, aby mieszanina nie zaczęła się utwardzać.

Delikatnie usuń 40 mikrolitrów pożywki ze studzienki zawierającej sferoidę guza. Zachowaj te 40 mikrolitrów podczas wykonywania następnego kroku. Sprawdź studnię, aby zobaczyć, czy sferoida została usunięta w poprzednim kroku. Jeśli nie, umieść 40 mikrolitrów z powrotem w studzience i powtórz poprzedni krok.

Jeśli tak, dodaj 40 mikrolitrów zawierających sferoidę do fiolki 1. Delikatnie wymieszać fiolkę 1 przed przeniesieniem mieszaniny w porcjach o pojemności 60 mikrolitrów do trzech oddzielnych dołków na 96-dołkowej płytce. Po dodaniu mieszaniny sprawdź każdą studzienkę pod mikroskopem, aby określić, która studzienka zawiera sferoidę.

Następnie dodać około 2 mikrolitry 1 molowego wodorotlenku sodu i 40 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do fiolki 2 i przetoczyć wir przed porcjowaniem 60 mikrolitrów tej mieszaniny do pustego dołka w 96-dołkowej płytce i oznaczyć ją jako kontrolę bezkomórkową. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby utwardzała się przez co najmniej godzinę.

Aby skonstruować siatkę punktów próbnych, najpierw przenieś płytkę z próbką z inkubatora na stolik mikroskopu. Odczekać 10 minut, aż próbka zrównoważy się do temperatury pokojowej, jeśli podgrzewany stage nie jest dostępny. Obserwuj próbkę za pomocą soczewek obiektywowych o małej mocy, aby upewnić się, że jest nienaruszona i gotowa do obrazowania. Określ położenie guza w studni i udokumentuj to za pomocą obrazu w świetle przechodzącym w celu późniejszej korejestracji przestrzennej.

Zazwyczaj 20 punktów próbkowania w każdym dołku rozmieszczonych w koncentrycznych pierścieniach wokół sferoidy daje odpowiednio szczegółowe wyniki. Przesuń stolik do każdej żądanej pozycji i użyj oprogramowania do łączenia mikroskopów, aby zarejestrować współrzędne x i y.

Przełącz mikroskop na soczewkę obiektywową o dużej mocy i wybierz odpowiednią kostkę filtrującą dla długości fali wzbudzenia sond znacznikowych. Korzystając z listy utworzonych punktów, przejdź do pierwszego punktu w siatce. Dostosuj ostrość, aby znaleźć dno studni, zanim przejdziesz w górę, aby znaleźć pole view zawierające kilka ostrych sond śledzących.

Obserwuj histogram intensywności i dostosuj intensywność i czas ekspozycji, aby uzyskać jak największy zakres dynamiki, jednocześnie upewniając się, że obraz nie zostanie nasycony. Uzyskaj sekwencję wideo z szybkością od 20 do 30 milisekund na klatkę i zapisz ją z odpowiednią konwencją nazewnictwa. Podczas nagrywania nie dotykaj mikroskopu ani stołu.

Powtórz zapis dla każdego punktu próbkowania w siatce. Następnie przystąp do powtórzenia procesu w celu skonstruowania siatki dla każdej studzienki w eksperymencie i powtórz cały proces dla każdego punktu czasowego w czasie trwania monitorowania podłużnego.