Wykrywanie ROS za pomocą barwienia DCFH-DA: pomiar całkowitego ROS w liniach komórkowych raka jelita grubego

- Reaktywne formy tlenu są wytwarzane głównie z mitochondriów, gdy elektrony wyciekają z łańcucha transportu elektronów. Elektrony te łączą się z tlenem cząsteczkowym, dając początek różnym reaktywnym formom tlenu lub ROS. W komórkach nowotworowych dochodzi do nadprodukcji reaktywnych form tlenu. Te wysoce reaktywne cząsteczki ROS mogą oksydacyjnie uszkadzać błony, białka i DNA wewnątrz komórki.

Zwiększony poziom ROS uszkadza DNA, prowadząc do aktywacji onkogennego szlaku sygnałowego powodującego progresję raka. Dlatego tak ważne jest wykrycie poziomów reaktywnych form tlenu wytwarzanych przez komórki nowotworowe.

Zacznij od pobrania komórek rakowych z ludzkiego raka jelita grubego w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Następnie zasiej te komórki na płytce wielodołkowej i dodaj roztwór DCFH-DA. Inkubuj płytkę przez żądany czas. DCFH-DA przenika przez błonę komórkową. Po wejściu do komórki DCFH-DA przekształca się w DCFH w obecności enzymu esterazy komórkowej. Co więcej, utlenianie DCFH przez reaktywne formy tlenu daje zielone cząsteczki fluorescencyjne.

Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Intensywność zielonej fluorescencji wskazuje na poziom reaktywnych form tlenu w ko