$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Wzbogacanie środowiska lub EE odnosi się do modyfikacji parametrów pomieszczeń w celu uzyskania korzystnego wpływu na różne choroby, takie jak rak. U myszy z nowotworem EE aktywuje układ odpornościowy i zmniejsza stan zapalny, co ostatecznie poprawia mikrobiotę jelitową i poprawia przeżywalność. Aby zbadać zmiany w mikrobiocie jelitowej, dodaj żądaną ilość buforu do lizy stolca do probówki zawierającej stolec myszy.
Odwirować próbkę i przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodaj bufor do lizy chlorku guanidyny, który denaturuje DNazę i RNazę. Następnie dodaj etanol i przenieś próbkę do kolumny wirowej z krzemionką.
Etanol pomaga DNA wiązać się z krzemionką. Odwirować próbkę. Teraz przenieś kolumnę do świeżej probówki mikrowirówkowej i dodaj bufor elucyjny do kolumny, aby wymyć DNA.
Odwirować próbkę i wyrzucić kolumnę. Przenieś próbkę do probówki PCR i uruchom PCR w celu amplifikacji DNA. Załaduj DNA na żel agarozowy i wykonaj elektroforezę, aby określić ilościowo rozmiar DNA drobnoustrojów. W poniższym protokole wyizolujemy DNA z kału, aby przeanalizować wpływ EE na mikrobiotę okrężnicy u myszy rakotwórczej.
- Wykorzystaj komercyjny zestaw do wyizolowania drobnoustrojowego DNA ze stolca zgodnie z protokołem wykrywania patogenów w stolcu. W tym celu należy przenieść próbki z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na suchy lód i zważyć je. Następnie należy przeprowadzić test PCR, który amplifikuje DNA drobnoustrojów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie oczyść produkty reakcji za pomocą kulek magnetycznych.
W celu oczyszczenia, najpierw należy na krótko odwirować płytkę amplikonową PCR, aby wyciągnąć produkty reakcji. Następnie należy wymieszać kulki magnetyczne, aby równomiernie je rozproszyć i przenieść 20 mikrolitrów porcji do każdej studni reakcyjnej. Dokładnie wymieszać kulki z roztworem, powoli pipetując całą objętość 10 razy. Następnie pozwól koralikom osiąść na 5 minut.
Następnie umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym i odczekaj 2 minuty, aż supernatanty znikną po magnetycznym zebraniu kulek. Następnie usunąć i wyrzucić supernatanty. Następnie, trzymając płytkę nadal na magnesie, napełnij każdą studzienkę koralików 200 mikrolitrami świeżego 80-procentowego etanolu i odczekaj 30 sekund. Następnie ostrożnie usuń supernatant.
Powtórz ten krok prania raz i pozostaw koraliki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Teraz wymyj produkty reakcji z kulek, wyjmując płytkę ze stojaka magnetycznego i dodając 52,5 mikrolitrów Tris do każdej studzienki. Całkowicie wymieszać kulki z roztworem, odpipetowując powoli całą objętość 10 razy. Następnie zbierz kulki na stojaku magnetycznym jak poprzednio i przenieś 50 mikrolitrów supernatantów na czystą płytkę PCR. Przykryj płytkę przezroczystym klejem i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do tygodnia.