Znakowanie komórek organoidowych CRC: metoda generowania komórek organoidowych raka jelita grubego transdukowanych przez GFP lentiwirusem

- Organoidy to trójwymiarowe konstrukty komórkowe in vitro, które samoorganizują się, naśladując kluczowe cechy tkankowe narządu, z którego pochodzą. Aby rozpocząć znakowanie, należy potraktować zebrane organoidy koktajlem enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych w celu dysocjacji komórek do zawiesiny. Odwirować w celu oddzielenia komórek od supernatantu zawierającego enzymy. Odrzucić supernatant. Rozpuścić osad komórkowy za pomocą pożywki zawierającej wektory lentiwirusowe. Te rekombinowane wirusy przenoszą sekwencję kodującą białko zielonej fluorescencji lub GFP.

Wirusy łączą się z komórkami i uwalniają swój materiał genetyczny oraz niektóre enzymy wirusowe do cytoplazmy. Wirusowa odwrotna transkryptaza syntetyzuje komplementarne wirusowe DNA, które przemieszcza się do jądra gospodarza. Integraza wirusowa pomaga włączyć wirusowe DNA zawierające sekwencję GFP do genomu gospodarza. Hoduj te transdukowane komórki w macierzy zewnątrzkomórkowej lub płytce hodowlanej pokrytej ECM. Odessać pożywkę i odwirować, aby zebrać wszelkie nieprzyłączone komórki. Zawieś komórki w dodatkowym ECM.

Nałóż zawiesinę na przylegającą kulturę, aby zwiększyć żywotność komórek. Gdy matryca zestali, dodaj pożywkę hodowlaną i inkubuj, aby ułatwić tworzenie organoidów. Obserwuj kulturę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Transdukowane komórki syntetyzują białka zielonej fluorescencji. Organoidy utworzone z tych komórek wykazują dodatni wynik GFP. Poniższy protokół demonstruje transdukcję lentiwirusa GFP do komórek organoidowych raka jelita grubego pochodzących od pacjenta.

- Po 7 do 10 dniach hodowli należy odłączyć organoidy mechanicznie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i przenieść organoidy do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych w celu ich odwirowania. Następnie ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach PBS z delikatnym stukaniem w celu ponownego odwirowania. Aby oddzielić organoidy raka jelita grubego, dodaj 500 mikrolitrów roztworu enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych do probówek i wymieszaj, delikatnie stukając.

Po 10 minutach w temperaturze pokojowej dodaj do komórek 500 mikrolitrów pożywki uzupełnionej 1% FBS i bardzo delikatnie kilkakrotnie pipetuj zawiesinę komórkową, aby rozbić organoidy.

- Delikatne pipetowanie ludzkich organoidów CRC podczas pasażowania ma kluczowe znaczenie dla utrzymania nienaruszonej formacji sferoidowej w hodowli.

- Ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach 5x lentiwirusa GFP i 400 mikrolitrach świeżej pożywki organoidowej raka jelita grubego.

- Niezbędne jest zakażenie ludzkich organoidów CRC wysokim mianem lentiwirusa GFP, w szczególności w celu osiągnięcia prawie 100% skuteczności infekcji.

- Dostosuj objętość w każdej probówce, aby uzyskać 5 razy 10 do piątej zdysocjowanej komórki nowotworowej na 500 mikrolitrów średniego stężenia i umieść 500 mikrolitrów komórek w każdym dołku 12-dołkowej płytki pokrytej sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową, jak pokazano. Po 18 godzinach w inkubatorze do hodowli komórkowych przenieś pływające supernatanty zawierające komórki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek w celu odwirowania, a następnie ponownie zawiesić granulki w 70 mikrolitrach sztucznej matrycy zewnątrzkomórkowej na probówkę na lodzie.

Aby zwiększyć żywotność komórek raka jelita grubego, nałóż sztuczną macierz zewnątrzkomórkową zawierającą komórki nowotworowe na organoidy nowotworowe na 12-dołkowej płytce i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 minut. Gdy powłoka sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej zestala się, nakarmić kultury 1 mililitrem świeżej pożywki do hodowli organoidów CRC uzupełnionej 1% FCS i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na trzy dni. Następnie obserwuj zainfekowane komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić prawie 100% dodatni wynik GFP i zwróć komórki do inkubatora na kolejne 4 do 6 dni.