JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 2:57 min. • April 30th, 2023
- Zacznij od kultury białka zielonej fluorescencji lub GFP, wyrażającego organoidy raka jelita grubego. Zbierz organoidy. Potraktuj roztworem enzymu odłączającego komórki, aby zdysocjować organoidy w zawiesinę jednokomórkową. Odwirować w celu oddzielenia supernatantu zawierającego enzym. Usunąć supernatant. Zawiesić komórki raka jelita grubego wykazujące ekspresję GFP za pomocą sztucznej pożywki zawierającej macierz zewnątrzkomórkową. Załadować zawiesinę komórek do strzykawki i utrzymywać ją na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się matrycy w temperaturze otoczenia.
Następnie przygotuj znieczuloną mysz w pozycji leżącej. Delikatnie wyciągnij warstwę śluzówkową odbytnicy przez otwór odbytu. Teraz wstrzyknij przygotowaną zawiesinę komórek rakowych wykazujących ekspresję GFP do warstwy podśluzówkowej odbytnicy zawierającej sieć naczyń krwionośnych. Pozwól myszy na odzyskanie sprawności.
W ciągu kilku dni w miejscu wstrzyknięcia rozwija się guz pierwotny wykazujący ekspresję GFP. W przypadku spontanicznych przerzutów te komórki nowotworowe odłączają się i wchodzą do krążenia. W końcu komórki wynanaczyniają się do odległych narządów i namnażają się, tworząc guzy przerzutowe GFP-dodatnie. W poniższym protokole pokażemy generowanie mysiego modelu raka jelita grubego z spontanicznymi przerzutami poprzez ortotopowe wstrzykiwanie komórek organoidów jelita grubego wykazujących ekspresję GFP.
- Aby ustalić mysi model spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów z CRC, należy rozdzielić organoidy znakowane GFP, jak pokazano, i rozcieńczyć zawiesiny pojedynczych komórek nowotworowych w proporcji 5 razy 10 do pięciu komórek nowotworowych na 50 mikrolitrów PBS, uzupełnionych 50% sztucznym stężeniem macierzy zewnątrzkomórkowej. Załaduj 50 mikrolitrów komórek na mysz do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 22 i umieść komórki nowotworowe na lodzie.
Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i umieść pierwszą znieczuloną mysz NOG w pozycji leżącej na stole laboratoryjnym. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyciągnij błonę śluzową odbytnicy z odbytu i natychmiast wstrzyknij komórki nowotworowe do błony podśluzowej odbytnicy.