JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:19 min • April 30th, 2023
- Zacznij od pobrania znieczulonej warunkowo zmutowanej myszy ze zmodyfikowanym genomem zawierającym specyficzne sekwencje rozpoznawania enzymów rekombinazy Cre zwane wstawkami LoxP, które otaczają pożądany gen supresorowy guza, który ma zostać zmutowany. Chirurgicznie odsłonić jamę brzuszną. Zlokalizuj dystalną okrężnicę i zaciśnij jej górną część. Przezodbytniczo włóż rurkę klasy medycznej i wsuń ją do dystalnej okrężnicy. Przepłucz okrężnicę solą fizjologiczną, aby usunąć wszelkie kały. Wymień rurkę. Zaciśnij dolną część okrężnicy w celu segmentacji. Nadmuchać segment za pomocą odpowiedniego roztworu do dysocjacji komórek. Powoduje to perforację bariery śluzówkowej i zwiększa dostępność komórek krypty jelitowej. Wypłukać roztwór dysocjacyjny.
Następnie wstrzyknąć zawiesinę adenowirusową do segmentu okrężnicy. Te zmodyfikowane wektory wirusowe kodują enzymy rekombinazy Cre. Wirus wnika do komórki, uwalnia swoje DNA do jądra i ulega ekspresji enzymów. Białka rozpoznają insercje LoxP w genomie gospodarza i katalizują rekombinację specyficzną dla miejsca, dezaktywując w ten sposób gen supresorowy guza. Ta mutacja powodująca utratę funkcji sprzyja progresji raka. Zszyj nacięcie i pozwól myszy dojść do siebie. Monitoruj, aby obserwować wzrost izolowanych guzów jelita grubego. Poniższy protokół przedstawia generowanie mysiego modelu raka jelita grubego przez segmentowe zakażenie adeno-cre.
- Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy w pozycji leżącej na plecach i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Przyklej mysz taśmą w bezpiecznej pozycji, a następnie potwierdź odpowiedni poziom sedacji, ściskając palce. Wykonaj około 15-milimetrowe nacięcie w linii środkowej w skórze dolnej części brzucha. Następnie użyj kleszczy, aby chwycić mięśnie ściany brzucha i ostrożnie naciąć mięsień nożyczkami, aby otworzyć jamę brzuszną. Po zidentyfikowaniu dystalnej części jelita grubego ostrożnie zaciśnij tkankę delikatnym zaciskiem około 15 milimetrów proksymalnie do odbytu.
Następnie włóż elastyczną rurkę teflonową przezodbytniczo, ostrożnie przesuwając rurkę, aż dotrze do okluzji światła i kaniuluj rurkę za pomocą kaniuli o rozmiarze 30. Podłącz standardową strzykawkę o pojemności 1 mililitra do kaniuli i przepłucz okrężnicę kilkoma mililitrami normalnej soli fizjologicznej, aż cały kał zostanie usunięty. Gdy dystalna okrężnica jest pusta, wymień rurkę z solą fizjologiczną na nową rurkę teflonową i użyj drugiego zacisku, aby zatkać okrężnicę około 3 milimetry dystalnie do pierwszego zacisku.
Używając drugiej strzykawki o pojemności 1 mililitra wyposażonej w kaniulę o rozmiarze 30, ostrożnie wstrzyknij od 50 do 80 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA do zaciśniętego segmentu okrężnicy. Okrężnica powinna napompować się na tyle, aby rozbić barierę śluzówkową bez perforacji zaciśniętego segmentu tkanki. Po 10 minutach zdejmij dystalny zacisk. Następnie wyjmij rurkę z trypsyną i przepłucz dystalną okrężnicę 500 mikrolitrami zwykłej soli fizjologicznej.
Po włożeniu nowej rurki teflonowej ponownie zaciśnij okrężnicę i napompuj tkankę 50 do 80 mikrolitrami roztworu adenowirusa. Po 30 minutach zdejmij zaciski i rurkę i zamknij ścianę brzucha szybko wchłaniającymi się szwami biegowymi 6-0. Zamknij skórę klipsami chirurgicznymi do ran i monitoruj zwierzę na poduszce grzewczej, aż w pełni wyzdrowieje.
Aby monitorować wzrost guza za pomocą kolonoskopii, umieść znieczulone zwierzę z guzem w pozycji leżącej na poduszce grzewczej i przezodbytniczo wprowadź endoskop do przewodu pokarmowego. Delikatnie wdmuchuj powietrze pod kontrolą wzrokową, aby rozciągnąć okrężnicę. Następnie ostrożnie popchnij lunetę do przodu, aż będzie można zidentyfikować zmianę błony śluzowej w dalszej części okrężnicy, zapisując każdy obraz endoskopowy w miarę jego pozyskiwania do późniejszej oceny. Po uzyskaniu wszystkich obrazów powoli wyjmij endoskop i umieść mysz na poduszce grzewczej o temperaturze 38 stopni Celsjusza, aż do całkowitego wyzdrowienia.