Test fosfatazy w komórkach CRC: metoda badania stanu fosforylacji białka Tau w komórkach raka jelita grubego

- Białko Tau lokalizuje się obwodowo do jąderka w komórkach raka jelita grubego i pomaga w utrzymaniu struktury jąderka. Przeważnie komórki te wyrażają hiperfosforylowane białko tau, co skutkuje opornością na leki. W związku z tym analizujemy poziomy fosforylacji tau, wykonując test fosfatazy.

Rozpocznij od pobrania lizatu komórkowego zawierającego całkowite białko z ludzkich komórek raka jelita grubego w dwóch fiolkach oznaczonych jako test i kontrola. Badaną próbkę należy poddać działaniu enzymu fosfatazy alkalicznej. Fosfataza alkaliczna usuwa grupy fosforanowe z tau, podczas gdy fiolka kontrolna zachowuje fosforylowane białko tau.

Następnie uruchom zarówno próbkę, jak i kontrolne tau na żelu poliakrylowamidowym, aby oddzielić białka. Ufosforylowane tau porusza się wolniej w żelu niż nieufosforylowane białko tau. Elektroklemować próbkę białka na odpowiedniej błonie i dodać pierwszorzędowe przeciwciała odpowiadające zarówno fosforylowanemu, jak i normalnemu tau.

Inkubuj blot przez noc. Potraktuj blot przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem reporterowym, które wiąże się z regionem Fc przeciwciała pierwszorzędowego. Na koniec rozwiń blot za pomocą substratu chemiluminescen