Test fosfatazy w komórkach CRC: metoda badania stanu fosforylacji białka Tau w komórkach raka jelita grubego

0 wyświetleń4:22 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Białko Tau lokalizuje się obwodowo do jąderka w komórkach raka jelita grubego i pomaga w utrzymaniu struktury jąderka. Przeważnie komórki te wyrażają hiperfosforylowane białko tau, co skutkuje opornością na leki. W związku z tym analizujemy poziomy fosforylacji tau, wykonując test fosfatazy.

Rozpocznij od pobrania lizatu komórkowego zawierającego całkowite białko z ludzkich komórek raka jelita grubego w dwóch fiolkach oznaczonych jako test i kontrola. Badaną próbkę należy poddać działaniu enzymu fosfatazy alkalicznej. Fosfataza alkaliczna usuwa grupy fosforanowe z tau, podczas gdy fiolka kontrolna zachowuje fosforylowane białko tau.

Następnie uruchom zarówno próbkę, jak i kontrolne tau na żelu poliakrylowamidowym, aby oddzielić białka. Ufosforylowane tau porusza się wolniej w żelu niż nieufosforylowane białko tau. Elektroklemować próbkę białka na odpowiedniej błonie i dodać pierwszorzędowe przeciwciała odpowiadające zarówno fosforylowanemu, jak i normalnemu tau.

Inkubuj blot przez noc. Potraktuj blot przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem reporterowym, które wiąże się z regionem Fc przeciwciała pierwszorzędowego. Na koniec rozwiń blot za pomocą substratu chemiluminescencyjnego, aby zidentyfikować białko tau od całkowitej próbki białka obecnego w blot. W poniższym protokole zademonstrujemy test fosfatazy w celu oceny ogólnego stanu fosforylacji tau w komórkach CRC.

- Po przygotowaniu próbek zawierających 20 mikrogramów białka ogółem, do każdej dodać dwa mikrolitry buforu fosfatazy alkalicznej i 10 mikrolitrów fosfatazy alkalicznej. Następnie dodaj wodę destylowaną tak, aby końcowa objętość każdej próbki wynosiła 20 mikrolitrów.

Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Podczas inkubacji próbek należy przygotować dodatkowe próbki o tym samym stężeniu, ale bez fosfatazy do porównania. Po godzinie zatrzymaj reakcję, dodając EDTA o końcowym stężeniu 50 milimoli lub ortowanadan sodu o końcowym stężeniu 10 milimolów.

Dodaj świeżo przygotowany bufor ładujący żel 4X SDS zawierający 400 milimolowy DTT. Używając bloku grzewczego, inkubować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zwirować próbki, a następnie pozostawić je do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.

Następnie załaduj 13 mikrolitrów próbki na studnię, a także drabinkę masy cząsteczkowej na 10% żelu poliakrylamidowym. Podłącz system elektroforezy do źródła zasilania i ustaw napięcie na 70 woltów na 20 minut, aby przenieść próbki białek z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego.

Następnie zwiększ do 125 V i uruchom żel przez około 70 do 120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Za pomocą mokrego systemu do elektroblotty przenieś żel na membranę z polifluorku winylidenu o napięciu 100 woltów przez około 100 minut.

Następnie inkubować błonę, aby osuszyć 4% albuminę surowicy bydlęcej przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Inkubuj blot przez noc w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj plamę trzy razy w PBST, za każdym razem myjąc przez siedem minut.

Inkubować w odpowiednim roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj PBST cztery razy, przy czym każde pranie trwa siedem minut. Rozwiń blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta.

Przykryj wywołaną plamę przezroczystą folią plastikową, a następnie uzyskaj obrazy chemiluminescencji blot za pomocą dostępnego na rynku systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.

09:22

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

09:49

In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:59

Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

13:38

Monitorowanie aktywności kinaz i fosfataz w cyklu komórkowym za pomocą ratiometrycznego FRET

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:28

Test wiązania mikrotubul w komórkach CRC: metoda badania białka Tau wiążącego mikrotubule w komórkach raka jelita grubego

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:14

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

04:47

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego w celu identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

12:47

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

12:55

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

08:55

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026