$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Białko Tau lokalizuje się obwodowo do jąderka w komórkach raka jelita grubego i pomaga w utrzymaniu struktury jąderka. Przeważnie komórki te wyrażają hiperfosforylowane białko tau, co skutkuje opornością na leki. W związku z tym analizujemy poziomy fosforylacji tau, wykonując test fosfatazy.
Rozpocznij od pobrania lizatu komórkowego zawierającego całkowite białko z ludzkich komórek raka jelita grubego w dwóch fiolkach oznaczonych jako test i kontrola. Badaną próbkę należy poddać działaniu enzymu fosfatazy alkalicznej. Fosfataza alkaliczna usuwa grupy fosforanowe z tau, podczas gdy fiolka kontrolna zachowuje fosforylowane białko tau.
Następnie uruchom zarówno próbkę, jak i kontrolne tau na żelu poliakrylowamidowym, aby oddzielić białka. Ufosforylowane tau porusza się wolniej w żelu niż nieufosforylowane białko tau. Elektroklemować próbkę białka na odpowiedniej błonie i dodać pierwszorzędowe przeciwciała odpowiadające zarówno fosforylowanemu, jak i normalnemu tau.
Inkubuj blot przez noc. Potraktuj blot przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z enzymem reporterowym, które wiąże się z regionem Fc przeciwciała pierwszorzędowego. Na koniec rozwiń blot za pomocą substratu chemiluminescencyjnego, aby zidentyfikować białko tau od całkowitej próbki białka obecnego w blot. W poniższym protokole zademonstrujemy test fosfatazy w celu oceny ogólnego stanu fosforylacji tau w komórkach CRC.
- Po przygotowaniu próbek zawierających 20 mikrogramów białka ogółem, do każdej dodać dwa mikrolitry buforu fosfatazy alkalicznej i 10 mikrolitrów fosfatazy alkalicznej. Następnie dodaj wodę destylowaną tak, aby końcowa objętość każdej próbki wynosiła 20 mikrolitrów.
Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Podczas inkubacji próbek należy przygotować dodatkowe próbki o tym samym stężeniu, ale bez fosfatazy do porównania. Po godzinie zatrzymaj reakcję, dodając EDTA o końcowym stężeniu 50 milimoli lub ortowanadan sodu o końcowym stężeniu 10 milimolów.
Dodaj świeżo przygotowany bufor ładujący żel 4X SDS zawierający 400 milimolowy DTT. Używając bloku grzewczego, inkubować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zwirować próbki, a następnie pozostawić je do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut.
Następnie załaduj 13 mikrolitrów próbki na studnię, a także drabinkę masy cząsteczkowej na 10% żelu poliakrylamidowym. Podłącz system elektroforezy do źródła zasilania i ustaw napięcie na 70 woltów na 20 minut, aby przenieść próbki białek z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego.
Następnie zwiększ do 125 V i uruchom żel przez około 70 do 120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Za pomocą mokrego systemu do elektroblotty przenieś żel na membranę z polifluorku winylidenu o napięciu 100 woltów przez około 100 minut.
Następnie inkubować błonę, aby osuszyć 4% albuminę surowicy bydlęcej przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Inkubuj blot przez noc w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj plamę trzy razy w PBST, za każdym razem myjąc przez siedem minut.
Inkubować w odpowiednim roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj PBST cztery razy, przy czym każde pranie trwa siedem minut. Rozwiń blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z instrukcjami producenta.
Przykryj wywołaną plamę przezroczystą folią plastikową, a następnie uzyskaj obrazy chemiluminescencji blot za pomocą dostępnego na rynku systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.