JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:28 min • April 30th, 2023
- Tau jest białkiem związanym z mikrotubulami, zaangażowanym w stabilizację i składanie mikrotubul. Wiele komórek nowotworowych ulega ekspresji hiperfosforylowanego białka tau, które nie jest w stanie utrzymać dobrze zorganizowanego wiązania mikrotubul. Aby zbadać interakcję między białkiem tau a mikrotubulami, dodaj lizat komórek rakowych zawierający białko tau i roztwór roboczy mikrotubul w probówce do mikrofuge.
Nieufosforylowane białka tau obecne w lizacie komórkowym wiążą się z mikrotubulami. Teraz dodaj żądaną ilość buforu PEM do probówki, aby ustabilizować aktywność tubuliny, białka, które polimeryzuje w włókna, tworząc mikrotubule. Inkubuj mieszaninę przez żądany czas.
Odwirować mieszaninę w celu osadzenia białka związanego z mikrotubulami. Niezwiązane białko pozostaje w supernatancie. Przenieść supernatant do świeżej probówki i ponownie zawiesić osad w odpowiednim buforze. Dodać bufor ładujący żel do ponownie zawieszonej zawiesiny osadów i uruchomić próbki na żelu poliakrylamidowym, aby oddzielić białko związane z mikrotubulami i elektroblot na odpowiedniej membranie.
Dodać odpowiednie przeciwciała i rozwinąć blot za pomocą substratu chemiluminescencyjnego w celu identyfikacji związanych białek tau. W poniższym protokole przeprowadzimy test wiązania mikrotubul w celu identyfikacji białek związanych z mikrotubulami.
- Po przygotowaniu świeżych próbek inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Ultraodwirować próbki w temperaturze 100 000 x g i temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie przenieś 120 mikrolitrów każdego supernatantu zawierającego niezwiązane tau do oddzielnych czystych i oznakowanych probówek. Dodać 120 mikrolitrów 5-krotnego buforu do próbki do osadu zawierającego związane tau.
Po dokładnym wymieszaniu przez wirowanie i pipetowanie, przenieść mieszaninę do czystych, oznakowanych probówek. Po przygotowaniu próbek o równoważnym stężeniu białka dodać świeży 4X SDS żelowy bufor ładujący zawierający 400 milimolowy DTT. Użyj bloku grzewczego, aby inkubować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Zwiruj próbki, a następnie pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Załaduj 13 mikrolitrów próbki na studzienkę i drabinkę masy cząsteczkowej na 10% żelu poliakrylamidowym. Podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, a następnie ustaw napięcie na 70 woltów na 20 minut.
Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel przez około 70 do 120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu. Użyj mokrego systemu do elektrobibuły, aby przenieść żel na membranę z polifluorku winylidenu pod napięciem 100 woltów przez około 100 minut. Inkubować błonę, aby osuszyć 4% albuminę surowicy bydlęcej przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować przez noc w roztworze przeciwciała pierwotnego w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia przemyj blot cztery razy PBST, przy czym każde pranie trwa siedem minut. Inkubować przemytą plamę w odpowiednim roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj PBST przez siedem minut, powtarzając pranie w sumie cztery razy. Rozwiń blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji. Przykryj przezroczystą folią i uzyskaj obrazy za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.