Izolacja CTC z próbki krwi pełnej: metoda uzyskiwania CTC z mysiego modelu raka jelita grubego

- Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki rakowe, które wywodzą się z guza pierwotnego i dostają się do krążenia krwi. Większość CTC może przetrwać w krwiobiegu bez przyczepiania się do powierzchni; Dlatego możemy je wykryć bezpośrednio z krwi większości pacjentów z rakiem.

CTC we krwi mogą wskazywać na rozprzestrzenianie się guza w organizmie, dlatego ich identyfikacja pomaga zrozumieć progresję raka. Zacznij od pobrania znieczulonego mysiego modelu raka jelita grubego i pobierz krew przez nakłucie serca. Przenieść krew do stożkowej probówki zawierającej pożywkę o gradionym gradiencie gęstości i odwirować w celu oddzielenia składników krwi.

Odrzucić najwyższą warstwę zawierającą osocze i zebrać frakcję komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC obecną na granicy faz w oddzielnej probówce. Następnie dodaj przeciwciało anty-EpCAM do komórek PBMC i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym. Krążące CTC wyrażają marker komórkowy znany jako cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka lub EpCAM. Dlatego przeciwciała anty-EpCAM mogą pomóc w identyfikacji EpCAM dodatnich CTC.

Zbierz CTC i przechowuj je do dalszej analizy. W poniższym protokole zidentyfikujemy CTC wykazujące ekspresję EpCAM z obwodowej frakcji komórek jednojądrzastych krwi mysiego modelu raka jelita grubego.

- Aby wyizolować krążące komórki nowotworowe w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym, napełnij 15-mililitrowe stożkowe probówki 5 mililitrami pożywki gradientu gęstości na probówkę i ostrożnie przenieś próbki krwi pełnej pobrane od zwierząt z nowotworem na warstwy gradientu gęstości.

Oddzielić komórki przez odwirowanie i ostrożnie odzyskać granicę faz zawierającą komórki jednojądrzaste. Odpipetować komórki jednojądrzaste do nowej 15-mililitrowej probówki w celu drugiego odwirowania, a następnie dwukrotnego przepłukania w PBS. Po drugim praniu ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach PBS uzupełnionych EDTA i dodać cztery mikrolitry przeciwciała anty-EpCAM do każdej próbki na 20-minutową inkubację na lodzie w ciemności.

Następnie za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj około 1-centymetrowy okrąg w jednej sterylnej 6-centymetrowej szalce Petriego na próbkę i dodaj 700 mikrolitrów buforu do każdego koła, a następnie 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić gęstość komórek i pozwól próbkom osiąść przez około pięć minut. Następnie należy przebadać spadek komórek pod kątem dodatniego wyniku testu EpCAM i użyć mikromanipulatora do przeniesienia interesujących komórek do 50 mikrolitrów odpowiedniego buforu w celu zamierzonej późniejszej analizy.