Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

- Komórki generują siły mechaniczne, które działają na macierz zewnątrzkomórkową. Siła ta nazywana jest siłą pociągową. Komórki wywierają siły trakcyjne do wykonywania różnych zadań, takich jak migracja i proliferacja.

Przerzutowe komórki rakowe wywierają większe siły trakcyjne niż zdrowe komórki, dlatego przeprowadzamy test cytometrii trakcyjnej, aby zmierzyć siły trakcyjne wywierane przez komórki na elastyczne podłoża. Zacznij od zasiania pożądanej ilości komórek raka jelita grubego na hydrożelu poliakrylamidowym, żelu, który naśladuje ECM in vitro. Żel składa się z białek fibronektyny, które pomagają komórkom przylegać do powierzchni, oraz kulek fluorescencyjnych, które działają jako marker zmian położenia.

Inkubuj komórki przez żądany okres. Komórki przylegają do żelu i wywierają siłę pociągową, co powoduje przemieszczenie kulek fluorescencyjnych. Teraz umieść płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i zrób zdjęcie przemieszczonych koralików fluorescencyjnych. Następnie dodaj żądaną ilość trypsyny do płytki, aby odłączyć komórki i przeanalizować siłę pociągową wywieraną przez komórki za pomocą odpowiedniego oprogramowania. W poniższym protokole przeprowadzimy test mikroskopii siły trakcyjnej w celu analizy trakcji komórkowej ludzkich komórek raka jelita grubego.

- Aby wykonać test mikroskopii siły pociągowej, najpierw ogrzej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA 10% SDS do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu trakcyjnego. Usuwaj po jednym żelu z inkubatora do hodowli komórkowych i umieszczaj na stoliku mikroskopowym. Po znalezieniu pojedynczej komórki w polu widzenia zdejmij pokrywę szalki Petriego i wykonaj obraz komórki z kontrastem fazowym.

Następnie przełącz tryb obrazowania na fluorescencyjny i wybierz odpowiedni filtr. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki. Następnie zrób zdjęcie koralików fluorescencyjnych przemieszczonych przez trakcję komórkową. Teraz dodaj 1 mililitr roztworu trypsyny SDS do szalki Petriego, aby odłączyć komórkę od żelu. Zrób obraz referencyjny koralików po usunięciu komórki.