JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:23 min • April 30th, 2023
- Komórki macierzyste melanocytów w stanie spoczynku, w odpowiedzi na promieniowanie UV lub depilację włosów, ulegają aktywacji. Aktywowane komórki macierzyste czerniaka mogą prowadzić do czerniaka skóry - formy raka skóry. W celu zbadania czerniaka przygotowujemy zamrożone bloki tkanki skórnej, które zachowują natywne struktury DNA i białek podczas procedury utrwalania.
Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy z czerniakiem na łóżku chirurgicznym i usuń włosy z grzbietowej części skóry powyżej ogona. Wyciąć skórę i przykryć ją bibułą filtracyjną. Następnie zanurz bibułę filtracyjną zawierającą tkankę skórną w neutralnej buforowanej formalinie na żądany czas. Formalina wnika w tkankę skórną i wiąże się z aminokwasami, co powoduje sieciowanie białek, prowadząc w ten sposób do utrwalenia tkanek.
Usuń tkankę skórną z papieru i odetnij tkankę, aby uzyskać kawałki o pożądanej wielkości. Teraz osadź kawałki tkanki pionowo w kriofordzie wypełnionym pożywką OCT i umieść krioformy na suchym lodzie. OCT to matryca próbki, która krzepnie po zamrożeniu i tworzy galaretowatą warstwę wokół próbki tkanki, utrzymując ją na miejscu. Zamrożone bloki należy wykorzystać do dalszych badań histologicznych. W poniższym protokole przygotujemy zamrożone bloki tkanki skórnej z mysiej skóry grzbietowej do badania czerniaka skóry.
- Aby wyizolować próbki skóry, użyj elektrycznego trymera, aby usunąć wszelkie włosy z grzbietowego obszaru skóry poddanych eutanazji napromieniowanych myszy i delikatnie przeczesz odsłoniętą skórę niestrzępiącą się chusteczką, aby oczyścić obszar. Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami tuż nad podstawą ogona i włóż duże nożyczki do nacięcia, aby oddzielić podskórne tkanki łączne. Za pomocą ostrych nożyczek ostrożnie przeciąć wzdłuż krawędzi obszaru skóry, aby wyizolować próbkę tkanki, a następnie umieść wyciętą tkankę skórną na czystym ręczniku papierowym.
Następnie użyj kleszczy, aby rozciągnąć skórę tak, aby przylegała do ręcznika i była napięta. Po zebraniu wszystkich próbek należy umieścić próbkę skóry i spód z ręcznika papierowego w kawałku złożonej bibuły filtracyjnej bezpośrednio przylegającej do zagięcia, uważając, aby próbka była gładka i nie była pofałdowana ani pognieciona. Zamknij boki bibuły filtracyjnej zszywkami i przytnij bibułę. Następnie całkowicie zanurz próbki w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 3 do 5 godzin w temperaturze pokojowej przed umyciem tkanek dwoma 5-minutowymi płukaniami w wodzie dejonizowanej.
Po drugim przemyciu ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości materiału z tkanek skóry i przyciąć krawędzie próbki tak, aby nie były postrzępione. Następnie wykonaj trzy nacięcia strzałkowe w każdej próbce, tak aby szerokość pasków nie przekraczała 5 milimetrów i wykonaj cięcia poprzeczne, tak aby próbki nie miały więcej niż 20 milimetrów szerokości. Umieść kriomold zawierający optymalną temperaturę cięcia lub podłoże OCT w orientacji pionowej i umieść cztery do pięciu kawałków skóry na wierzchu OCT.
Gdy wszystkie kawałki są na swoim miejscu, użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby przysunąć długą krawędź każdego kawałka skóry do dna kriomoldu, tak aby próbki były pionowe w OCT i prostopadłe do podstawy formy. Następnie napełnij formę dodatkowym OCT do drugiej wargi i umieść formę na płaskiej powierzchni kawałka suchego lodu, używając kleszczyków do regulacji wszelkich kawałków skóry, które mogły się przesunąć podczas przenoszenia, gdy blok zaczyna zamarzać w razie potrzeby.