Metoda wiszącej kropli: technika generowania sferoid czerniaka 3D

- Sferoidy to trójwymiarowe modele hodowli komórkowych in vitro, które naśladują architekturę guza in vivo i pomagają badać interakcje wewnątrz guza. Aby założyć hodowlę, najpierw przygotuj jednokomórkową zawiesinę komórek czerniaka w odpowiednim pożywce. Następnie należy umieścić małe objętości tej zawiesiny komórkowej, wystarczająco oddalone od siebie, na wewnętrznej powierzchni pokrywki sterylnego, nieprzywierającego naczynia hodowlanego. Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na dnie naczynia hodowlanego zawierającego PBS, aby utworzyć komorę nawadniającą. Inkubować płytkę w odpowiednich warunkach.

Wilgoć z PBS zapobiega parowaniu mediów z wiszących kropli. Odśwież krople, zastępując kilka mikrolitrów pożywki. Dzięki napięciu powierzchniowemu kropelki zachowują swój kulisty kształt i pozostają zawieszone na wewnętrznej powierzchni płytki. Siły grawitacyjne ułatwiają komórkom pozostawanie w zawiesinie bez rozprzestrzeniania się, ale agregują, tworząc trójwymiarowe sferoidy w kropelkach. Na koniec przepłucz kropelki PBS, aby zebrać sferoidy. Zbierz je w nieprzywierającym naczyniu hodowlanym.

W poniższym protokole zademonstrujemy generowanie trójwymiarowych sferoid komórek czerniaka 451-LU metodą wiszącej kropli.

- Na początek hoduj komórki czerniaka 451-LU przy użyciu pożywki RPMI zawierającej 10% FCS, zgodnie z ogólnymi protokołami hodowli komórkowych. Aby wytworzyć sferoidy czerniaka, umyj wyhodowane komórki czerniaka w PBS. Następnie dodaj 5 mililitrów 1x Trypsin-EDTA w PBS. Inkubować przez 3 do 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 5 mililitrów RPMI zawierających 10% FCS, aby zneutralizować trypsynę. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Wirować przy 200 x g przez 5 minut, aby zebrać komórki. Ponownie zawiesić osad ogniwa w RPMI zawierający 10% FCS.

Następnie policz komórki i rozcieńcz zawiesinę komórkową do końcowego stężenia 10 000 komórek na mililitr. Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej wykonaj plamki zawiesiny komórek o wymiarach 40 x 25 mikrolitrów na wewnętrznej powierzchni pokrywki sterylnego, nieprzylepnego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórek.

Następnie odwróć pokrywkę szybkim, płynnym ruchem i umieść ją na naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym 5 mililitrów PBS. Hoduj wiszące naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 10 do 14 dni.

Pięć dni po początkowym zauważeniu kropli użyj elektronicznego dozownika, aby dodać 10 mikrolitrów RPMI zawierających 10% FCS do każdej kropli. Po 10 do 15 dniach zbierz sferoidy, delikatnie spłukując je z pokrywki PBS. Zbierz sferoidy w świeżym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórkowych.