JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:07 min. • April 30th, 2023
Skóra składa się przede wszystkim z górnej warstwy naskórka i dolnej warstwy skóry właściwej. Komórki naskórka są rozwarstwione na wiele warstw, od najmniej zróżnicowanych komórek obecnych u podstawy do wysoce zróżnicowanych komórek na obrzeżach. Aby wyhodować tkankę skórną naśladującą morfologiczne i biochemiczne aspekty normalnej skóry, możemy ustalić organtypowy model skóry.
Na początek weź płytkę wielodołkową z membraniastą wkładką. Dodaj fibroblasty skóry zmieszane z kolagenem do wkładki. Inkubuj, aby ułatwić krzepnięcie macierzy kolagenowej w celu osadzenia fibroblastów i naśladowania przedziału skórnego skóry.
Następnie dodaj zawiesinę komórek keratynocytów na warstwę skóry właściwej. Inkubować płytkę, aby keratynocyty przylegały do komory skórnej. Uzupełnij kulturę pożywką do naskórka, aby zainicjować proliferację keratynocytów i tworzenie warstwy naskórka.
Na koniec przenieś wkładki na świeżą płytkę wielodołkową. Dodaj pożywkę warstwową tak, aby pokrywała tylko podstawę konstrukcji, tworząc w ten sposób granicę faz powietrze-ciecz. Podczas inkubacji granica powietrze-ciecz ułatwia różnicowanie keratynocytów w warstwowy wielowarstwowy naskórek.
W poniższym protokole wygenerujemy organotypowe rekonstrukcje skóry 3D mające swoje odpowiedniki skórne i naskórkowe z izolowanych komórek skóry ludzkiej.
Aby wygenerować skórny odpowiednik rekonstrukcji skóry, umieść wkładki membranowe o wielkości porów 8 mikrometrów w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Dla każdej wkładki ponownie zamieszaj 100 000 fibroblastów w roztworze neutralizującym żel. Następnie szybko wymieszaj zawiesinę fibroblastów z kolagenem typu 1 w stosunku 1:3 w końcowej objętości 500 mikrolitrów bez tworzenia pęcherzyków.
Następnie za pomocą pipety dodaj zawiesinę do każdej wkładki. Wewnątrz sterylnego kaptura umieść wkładki w temperaturze pokojowej bez pożywki na 30 minut, aby żele skórne mogły się ustabilizować. Następnie przykryj żele DMEM i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po całonocnej inkubacji usuń DMEM z żeli skórnych i zrównoważ je z EGM przez 2 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wytworzyć naskórkowy odpowiednik rekonstrukcji skóry. Następnie za pomocą pipety usuń EGM z żeli.
Następnie ostrożnie zamknij 100 000 keratynocytów zawieszonych w 100 mikrolitrach EGM na wierzchu każdego żelu. Inkubuj rekonstrukcje przez 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby keratynocyty mogły przylgnąć do żelu skórnego. Za pomocą końcówki do pipety ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki.
Następnie przykryj każdą rekonstrukcję 800 mikrolitrami EGM i hoduj przez 7 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.
Ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładu za pomocą małej białej końcówki pipety.
W dniu 8 umieść wkładki w oddzielnych dołkach na płytce 6-dołkowej. Następnie dodaj 1,2 do 1,4 mililitra pożywki z przerzutowym czerniakiem do każdej studzienki, aby pokryć tylko podstawę rekonstrukcji skóry. Następnie inkubuj przez 10 do 17 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.