Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Skóra składa się przede wszystkim z górnej warstwy naskórka i dolnej warstwy skóry właściwej. Komórki naskórka są rozwarstwione na wiele warstw, od najmniej zróżnicowanych komórek obecnych u podstawy do wysoce zróżnicowanych komórek na obrzeżach. Aby wyhodować tkankę skórną naśladującą morfologiczne i biochemiczne aspekty normalnej skóry, możemy ustalić organtypowy model skóry.

Na początek weź płytkę wielodołkową z membraniastą wkładką. Dodaj fibroblasty skóry zmieszane z kolagenem do wkładki. Inkubuj, aby ułatwić krzepnięcie macierzy kolagenowej w celu osadzenia fibroblastów i naśladowania przedziału skórnego skóry.

Następnie dodaj zawiesinę komórek keratynocytów na warstwę skóry właściwej. Inkubować płytkę, aby keratynocyty przylegały do komory skórnej. Uzupełnij kulturę pożywką do naskórka, aby zainicjować proliferację keratynocytów i tworzenie warstwy naskórka.

Na koniec przenieś wkładki na świeżą płytkę wielodołkową. Dodaj pożywkę warstwową tak, aby pokrywała tylko podstawę konstrukcji, tworząc w ten sposób granicę faz powietrze-ciecz. Podczas inkubacji granica powietrze-ciecz ułatwia różnicowanie keratynocytów w warstwowy wielowarstwowy naskórek.

W poniższym protokole wygenerujemy organotypowe rekonstrukcje skóry 3D mające swoje odpowiedniki skórne i naskórkowe z izolowanych komórek skóry ludzkiej.

Aby wygenerować skórny odpowiednik rekonstrukcji skóry, umieść wkładki membranowe o wielkości porów 8 mikrometrów w 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Dla każdej wkładki ponownie zamieszaj 100 000 fibroblastów w roztworze neutralizującym żel. Następnie szybko wymieszaj zawiesinę fibroblastów z kolagenem typu 1 w stosunku 1:3 w końcowej objętości 500 mikrolitrów bez tworzenia pęcherzyków.

Następnie za pomocą pipety dodaj zawiesinę do każdej wkładki. Wewnątrz sterylnego kaptura umieść wkładki w temperaturze pokojowej bez pożywki na 30 minut, aby żele skórne mogły się ustabilizować. Następnie przykryj żele DMEM i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po całonocnej inkubacji usuń DMEM z żeli skórnych i zrównoważ je z EGM przez 2 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wytworzyć naskórkowy odpowiednik rekonstrukcji skóry. Następnie za pomocą pipety usuń EGM z żeli.

Następnie ostrożnie zamknij 100 000 keratynocytów zawieszonych w 100 mikrolitrach EGM na wierzchu każdego żelu. Inkubuj rekonstrukcje przez 1,5 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby keratynocyty mogły przylgnąć do żelu skórnego. Za pomocą końcówki do pipety ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki.

Następnie przykryj każdą rekonstrukcję 800 mikrolitrami EGM i hoduj przez 7 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładu za pomocą małej białej końcówki pipety.

W dniu 8 umieść wkładki w oddzielnych dołkach na płytce 6-dołkowej. Następnie dodaj 1,2 do 1,4 mililitra pożywki z przerzutowym czerniakiem do każdej studzienki, aby pokryć tylko podstawę rekonstrukcji skóry. Następnie inkubuj przez 10 do 17 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.