JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 6:00 min. • April 30th, 2023
- HCR-FISH, czyli hybrydyzacja łańcuchowa reakcji hybrydyzacyjnej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, wykrywa sekwencje wirusowych kwasów nukleinowych w genomie komórek zakażonych wirusem. Na początek napraw przylegającą kulturę komórek zakażonych wirusem i przeniknij ich błonę komórkową. Inkubuj komórki z buforem hybrydyzacyjnym, aby zredukować sygnał tła. Potraktuj komórki sondami inicjacyjnymi zawierającymi sekwencję inicjującą HCR i sekwencję komplementarną ukierunkowaną na DNA wirusa. Podgrzej próbkę, aby zdenaturować dwuniciowy DNA gospodarza do jednoniciowego DNA. Inkubuj próbkę, aby sonda mogła związać się z komplementarną docelową sekwencją wirusowego DNA.
Następnie potraktuj buforem amplifikacyjnym zawierającym dwa zestawy znakowanych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych do włosów, H1 i H2. Inkubować, aby ułatwić reakcję łańcuchową hybrydyzacji. Niesparowana sekwencja inicjatora wiąże się ze swoim komplementarnym ogonem H1, linearyzując strukturę spinki do włosów. Odsłonięta sekwencja H1 podobnie wiąże się ze swoim komplementarnym ogonem H2. Końcowy H2 nadal wiąże się z ogonem H1. W ten sposób sondy oznaczone fluorescencyjnie wzmacniają się wokół miejsca docelowego, emitując silny sygnał. Potraktuj próbkę DAPI, aby wybarwić jądra komórkowe.
Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wykryć jasną fluorescencję z ognisk replikacji w jądrach zakażonych komórek. W poniższym protokole pokażemy in situ HCR-DNA FISH w celu wykrycia genomu poliomawirusa z komórek Merkla w zakażonych pierwotnych ludzkich komórkach skóry.
- Najpierw przymocuj komórki do szkiełek nakrywkowych z 4% PFA w PBS przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS i potraktuj je 70% etanolem w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, aby przeniknąć do komórek. Następnego dnia zastąp etanol buforem hydratacyjnym sondy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 60 minut w celu wstępnej hybrydyzacji próbek. Na 30 minut przed zakończeniem inkubacji przed hybrydyzacją rozcieńczyć sondy w roztworze do hybrydyzacji sondy w rozcieńczeniu 1:500 i inkubować w temperaturze 45 stopni Celsjusza.
Po zakończeniu inkubacji odpipetować około 10 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny sondy na szkiełko mikroskopowe dla każdego szkiełka nakrywkowego. Umieść każde szkiełko nakrywkowe, komórką do dołu, na odpowiedniej kropli mieszanki hybrydyzacyjnej. Używając dużej ilości cementu gumowego, uszczelnij krawędzie i tył każdego szkiełka nakrywkowego do szkiełka. Ustaw szkiełka na płaskiej stronie bloku grzewczego i podgrzewaj je do 94 stopni Celsjusza przez 3 minuty. Następnie przenieś szkiełka do nawilżonej komory i inkubuj je w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez noc.
Następnego dnia za pomocą kleszczy ostrożnie oderwij cement gumowy. Umieść szkiełka nakrywkowe, komórką do góry, w dołkach 24-dołkowej płytki i umyj je trzykrotnie buforem do przemywania sondy w temperaturze pokojowej. Dodać 200 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut. W międzyczasie wyżarzaj każdą z dwóch oznaczonych oligonukleotydowych spinek do włosów, rozpoznając sondy w oddzielnych probówkach PCR, podgrzewając je do 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie schładzając je do temperatury pokojowej przez 30 minut. Wymieszać spinki do włosów w buforze wzmacniającym w rozcieńczeniu 1:50.
Następnie rozciągnij folię parafinową na otwartej powierzchni pokrywki 12-dołkowej płytki, aby uzyskać powierzchnię do reakcji amplifikacji. Odpipetować od 50 do 100 mikrolitrów kropelek mieszanki spinki do włosów na folię parafinową dla każdego szkiełka nakrywkowego. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń każde szkiełko nakrywkowe ze wstępnego amplifikacyjny roztwór i dotknij krawędzi porowatą, jednorazową chusteczką do wyschnięcia. Umieść każde wysuszone szkiełko nakrywkowe, komórką do dołu, na kropli amplifikacji. Przenieść pokrywkę płytki do wilgotnej komory i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej i w ciemności.
Następnego dnia należy zwrócić szkiełka nakrywkowe do dołków płytki 24-dołkowej. Dodać 5x DAPI zawierające SSCT w stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie należy dwukrotnie przemyć próbki 5x SSCT w temperaturze pokojowej. Zamontuj umyte szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych i użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do analizy komórek i zobrazowania próbek.