HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

- HCR-FISH, czyli hybrydyzacja łańcuchowa reakcji hybrydyzacyjnej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, wykrywa sekwencje wirusowych kwasów nukleinowych w genomie komórek zakażonych wirusem. Na początek napraw przylegającą kulturę komórek zakażonych wirusem i przeniknij ich błonę komórkową. Inkubuj komórki z buforem hybrydyzacyjnym, aby zredukować sygnał tła. Potraktuj komórki sondami inicjacyjnymi zawierającymi sekwencję inicjującą HCR i sekwencję komplementarną ukierunkowaną na DNA wirusa. Podgrzej próbkę, aby zdenaturować dwuniciowy DNA gospodarza do jednoniciowego DNA. Inkubuj próbkę, aby sonda mogła związać się z komplementarną docelową sekwencją wirusowego DNA.

Następnie potraktuj buforem amplifikacyjnym zawierającym dwa zestawy znakowanych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych do włosów, H1 i H2. Inkubować, aby ułatwić reakcję łańcuchową hybrydyzacji. Niesparowana sekwencja inicjatora wiąże się ze swoim komplementarnym ogonem H1, linearyzując strukturę spinki do włosów. Odsłonięta sekwencja H1 podobnie wiąże się ze swoim komplementarnym ogonem H2. Końcowy H2 nadal wiąże się z ogonem H1. W ten sposób sondy oznaczone fluorescencyjnie wzmacniają się wokół miejsca docelow