JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:54 min • April 30th, 2023
- Skóra składa się z różnych komórek zasiedlających jej różne warstwy. Melanocyty, komórki wytwarzające melaninę, lokalizują się na styku naskórkowo-skórnym, podczas gdy fibroblasty, komórki wytwarzające tkankę łączną, znajdują się w skórze właściwej.
Aby szybko wyizolować melanocyty i fibroblasty, zacznij od pobrania pnia uśpionego szczeniaka myszy. Przetnij skórę brzusznie na całej długości tułowia. Oderwij skórę zawierającą warstwę naskórka i skóry właściwej i zmiel tkankę na małe kawałki.
Teraz potraktuj buforem trawiennym zawierającym enzymy trypsyny i kolagenazy, które degradują macierz zewnątrzkomórkową, uwalniając komórki do zawieszenia. Odwirować w celu granulacji komórek i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce melanocytowej i przenieść zawiesinę do płytki wielodołkowej.
Podczas hodowli większość fibroblastów przylega do dna studzienki, podczas gdy melanocyty i inne komórki naskórka pozostają w zawiesinie. Odessać zawieszone komórki i dodać pożywkę specyficzną dla fibroblastów do kultury fibroblastów, aby pobudzić ich wzrost. Przenieść zasysaną zawiesinę do świeżej studzienki pokrytej kolagenem, aby wspomóc tworzenie przylegającej kultury.
Uzupełnij genetycyną, antybiotykiem i dodaj świeżą pożywkę do wzrostu melanocytów. Genetycyna selektywnie eliminuje wszelkie pozostałe fibroblasty, podczas gdy pożywka wspomaga wzrost melanocytów w stosunku do innych typów komórek naskórka. W poniższym protokole wyizolujemy melanocyty i fibroblasty ze skóry mysich szczeniąt.
- W komorze z przepływem laminarnym krótko zwiń tułów każdej uśpionej myszy na sterylnej szalce Petriego zawierającej 70% etanolu. Wyjmij mysz z etanolu i umieść ją na pustej sterylnej szalce Petriego. Następnie wysterylizuj nożyczki chirurgiczne w 70% etanolu. Użyj tych nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze po brzusznej stronie tułowia, zaczynając od szyi i kontynuując do ogona. Za pomocą sterylnych kleszczy oderwij skórę od tułowia myszy i usuń nadmiar tkanki tłuszczowej ze skóry właściwej.
Umieść skórę skórą właściwą do dołu w 6-dołkowym naczyniu zawierającym 3 mililitry 1x roztworu antybiotyku/antybiotyku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 do 3 minut. Następnie włącz rozdrabniacz tkanek i dostosuj ustawienia do pokazanych tutaj.
- Należy zachować ostrożność podczas montażu ostrza rozdrabniacza do tkanek i podczas obsługi maszyny.
- Przenieś skórę stroną właściwą do dołu do sterylnego naczynia do rozdrabniania tkanek i trzykrotnie przepuść skórę całkowicie przez rozdrabniacz do tkanek. Następnie przenieś homogenizowaną skórę do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej 3 mililitry buforu do trawienia skóry.
Za pomocą mikropipety P1000 wymieszaj powstałą zawiesinę, energicznie pipetując w górę i w dół dziesięć do piętnastu razy. Zakryj stożkową probówkę i inkubuj próbkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, upewniając się, że probówka jest odwracana co 3 do 5 minut.
Następnie odwirować probówkę w wahadłowym wirniku kubełkowym o sile 750 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby ujednorodnić komórki w skórze. Użyj mikropipety P1000, aby powoli i całkowicie usunąć bufor trawiący skórę, uważając, aby nie naruszyć granulki.
- Pamiętaj, aby odessać cały bufor trawienny skóry. Jeśli masz problemy, umyj osad komórkowy 2 do 3 mililitrami pożywki melanocytowej i powtórz wirowanie i usuń nadmiar buforu trawienia skóry.
- Następnie dokładnie ponownie zawieś osad komórkowy w 1 mililitrze pożywki melanocytowej, pipetując w górę iw dół piętnaście do dwudziestu razy za pomocą pipety P1000. Przenieś powstały roztwór komórkowy kroplami do niepowlekanego dołka w 6-dołkowym naczyniu zawierającym 1 mililitr pożywki melanocytowej. Inkubować posiaczoną jednorodność skóry w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 40 minut.
Następnie przenieś supernatant hodowlany z niepowlekanego naczynia do jednego dołka wstępnie umytego 6-dołkowego naczynia pokrytego kolagenem. Dodaj G418 do pożywki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 100 nanogramów na mililitr. Dodaj 2 mililitry pożywki fibroblastowej do jednego dołka niepowlekanego naczynia, które teraz zawiera przylegające fibroblasty. Inkubuj obie kultury przez noc w inkubatorze do kultur tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Po 16 do 24 godzinach inkubacji oddzielnie odessać pożywkę i wszelkie resztki z każdej kultury. Umyj każde naczynie dwukrotnie, używając 1 mililitra PBS do każdego mycia. Następnie dodaj 2 mililitry świeżej pożywki melanocytów do kultury melanocytów i dodaj 2 mililitry świeżej pożywki fibroblastów do kultury fibroblastów.