Preparat wirionu rekombinowanego poliomawirusa z komórek Merkla (MCPyV): technika wytwarzania rekombinowanego wirionu MCPyV o wysokim mianie

- Poliomawirus z komórek Merkla lub MCPyV jest dwuniciowym onkowirusem DNA o okrągłym genomie, który powoduje raka z komórek Merkla, rodzaj raka skóry. Aby przygotować wiriony MCPyV, najpierw potraktuj przylegającą kulturę komórek pakujących koktajlem zawierającym środek transfekcyjny, genom wirusa i dwa plazmidy ekspresyjne kodujące białka wymagane do promowania replikacji wirusa.

Podczas inkubacji odczynnik do transfekcji tworzy lipopleksy z plazmidami, ułatwiając ich dostarczanie do komórek pakujących. Po wejściu do jądra maszyneria komórkowa umożliwia ekspresję genomów wirusa i plazmidu. Plazmidy ekspresyjne kodują białka antygenu dużego guza i antygenu małego guza. Białka te przemieszczają się do jądra i napędzają replikację wirusowego DNA. Następnie genom wirusa koduje strukturalne białka kapsydu. Białka te przemieszczają się do jądra i pomagają w składaniu rekombinowanych wirionów.

Następnie zbierz wyhodowane komórki. Potraktuj je roztworem zawierającym detergent i DNazę. Detergent przeprowadza lizę komórek w celu uwolnienia wirusów. DNaza rozkłada wolne plazmidowe DNA z zawiesiny. Odwirować w celu oddzielenia resztek komórkowych w osadzie. Załadować supernatant zawierający wirusa do probówki zawierającej podłoże o odpowiednim gradieniu gęstości. Odwirować w celu uzyskania skoncentrowanych frakcji bogatych w wirion w pożywce gradientowej.

W poniższym protokole pokażemy przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV o wysokim mianie przy użyciu komórek 293TT.

- Późnym popołudniem lub wieczorem wysiewaj 6 milionów komórek 293TT-28 do 10-centymetrowej pożywki zawierającej uzupełnioną pożywkę DMEM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego ranka upewnij się, że komórki są w około 50% zlewne. Następnie transfekuj komórki 66 mikrolitrami odczynnika do transfekcji, 12 mikrogramami ponownie ligowanego izolatu MCPyV DNA R17b, 8,4 mikrograma plazmidu ekspresji ST pMtB i 9,6 mikrograma plazmidu ekspresji LT pADL. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Następnego dnia, gdy transfekowane komórki są już prawie zlewne, trypsynizuj komórki i przenieś je do 15-centymetrowej naczynia w celu dalszej ekspansji. Kiedy to naczynie stanie się prawie zlewne, przenieś komórki do trzech nowych 15-centymetrowych szalek. Kiedy te nowe naczynia staną się prawie zlewne, zbierz komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wirować przy 180 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie usuń supernatant i dodaj 1 objętość komórek DPBS-Mg.

Dodaj 25 mikromolowych siarczanów amonu, a następnie 0,5% Triton X-100, 0,1% benzonazy i 0,1% DNazy zależnej od ATP. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia schłodzić mieszaninę na lodzie przez 15 minut. Następnie dodać 0,17 objętości chlorku sodu. Wymieszaj i inkubuj na lodzie przez kolejne 15 minut. Wirować przy 12000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwrócić probówkę i powtórzyć wirowanie.

Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. Zawiesić osad w jednej objętości DBPS uzupełnionej 0,8 mola chlorku sodu. Wirować przy 12000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwrócić probówkę i powtórzyć wirowanie. Połączyć oba supernatanty i ponownie odwirować w temperaturze 12000 x g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Następnie za pomocą pipety nanieś gradienty jodiksonalu do cienkościennych 5-mililitrowych probówek poliallomerowych, jak opisano w protokole tekstowym. Załadować 3 mililitry klarowanego, zawierającego wirusy supernatantu na przygotowany gradient jodiksonowy. Wiruj z wirnikiem SW55ti o wydajności 234 000 x g i temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 3,5 godziny, upewniając się, że przyspieszenie i opóźnienie są ustawione na wolne. Po zakończeniu ultrawirowania zbierz 12 frakcji w silikonowanych probówkach.