JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 4:07 min. • April 30th, 2023
- Keratynocyty to główny typ komórek obecny w naskórku lub najbardziej zewnętrznej warstwie skóry. Aby genetycznie zmodyfikować keratynocyty, zacznij od hodowli retrowirusowych komórek feniksa. Następnie dodać mieszaninę zawierającą wektory retrowirusowe przenoszące gen będący przedmiotem zainteresowania i odczynnik do transfekcji. Inkubuj płytkę przez żądany czas.
Odczynnik do transfekcji ułatwia dostarczanie materiału genetycznego wirusa do komórek pakujących. Te specjalnie zaprojektowane komórki kodują białka niezbędne do produkcji retrowirusowego kapsydu i promują pakowanie retrowirusowego wektora RNA przenoszącego interesujący nas gen. Po zapakowaniu dojrzałe wirusy opuszczają komórki do pożywki. Teraz przenieś pożywkę zawieszoną wirusem do świeżego naczynia hodowlanego zawierającego pierwotne keratynocyty. Rozszerz kulturę za pomocą pożądanego kationowego roztworu polimeru.
Polimer kationowy neutralizuje ładunki ujemne na błonach wirusa i keratynocytów, zwiększając efektywność fuzji wirusa z powierzchnią komórki. Po fuzji wirus uwalnia swoje RNA do cytoplazmy komórki, która ulega odwrotnej transkrypcji na dwuniciowe DNA. To wirusowe DNA dostaje się do jądra i integruje się z genomem keratynocytów, prowadząc do zmian genetycznych. W poniższym protokole pokażemy modyfikację genetyczną pierwotnych ludzkich keratynocytów za pomocą transfekcji retrowirusowej.
- Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki feniksa w kompletnym pożywce na 6-dołkową płytkę o gęstości 800 000 komórek na dołek. W dniu transfekcji zmieszać 6 mikrolitrów odczynnika do transfekcji ze 100 mikrolitrami DMEM dla każdej studzienki, która ma być transfekowana i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać mieszaninę do probówki zawierającej 3 mikrogramy wektora retrowirusowego dla każdej studzienki, która ma być transfekowana i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj całą tę mieszaninę kroplami do każdej studzienki komórek feniksa i inkubuj komórki przez noc.
Dzień po transfekcji usuń pożywkę z komórek feniksa i dodaj 2 mililitry świeżej, kompletnej pożywki. Tego samego dnia ponownie zawiesić pierwotne ludzkie keratynocyty w pożywce wolnej od keratynocytów z antybiotykami i nasionami na 6-dołkowych płytkach o gęstości 75 000 komórek na dołek.
Następnego dnia zbierz pożywkę, która teraz zawiera cząsteczki wirusa z transfekowanych komórek feniksa. Przepuść pożywkę przez filtr 0,45 mikrona za pomocą strzykawki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające komórki. Dodać 5 mikrogramów na mililitr bromku heksadimetryny do przefiltrowanej pożywki zawierającej wirusa, aby pomóc w procesie infekcji.
Następnie pipetować 2 mililitry wirusa na keratynocyty posiane poprzedniego dnia. Następnie wirować 6-dołkowe płytki w wirówce o sile 200 x g przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu wyjmij i wyrzuć nośnik zawierający wirusa. Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS, a następnie dodaj świeży KCSFM. Następnego dnia należy zainfekować tę samą partię keratynocytów wirusem, postępując zgodnie z opisaną właśnie procedurą.