Test tworzenia kolonii keratynocytów: test in vitro oceniający zdolność keratynocytów do wzrostu w kolonie

- Test tworzenia kolonii określa zdolność poszczególnych komórek do namnażania się i tworzenia kolonii. Zacznij od wyciętej skóry mysiej i grzbietowej na płytce hodowlanej. Zeskrob tkankę podskórną i tłuszcz z brzusznej strony skóry. Potraktuj tkankę roztworem trawiącym. Enzymy proteolityczne w roztworze degradują macierz zewnątrzkomórkową, indukując dysocjację komórek naskórka.

Delikatnie zeskrob warstwę naskórka, aby uwolnić dysocjujące komórki i włosy do podłoża do zbioru. Przefiltrować zawiesinę przez odpowiednie sitko, aby zatrzymać włosy lub wszelkie zanieczyszczenia i uzyskać jednokomórkową zawiesinę komórek naskórka. Przenieś żądaną objętość tej zawiesiny komórkowej na płytkę pokrytą kolagenem zawierającą przylegającą warstwę komórek zasilających z zatrzymanym wzrostem. Uzupełnij odpowiednią pożywką, która sprzyja przeżyciu keratynocytów.

Podczas hodowli keratynocyty przyczepiają się do warstwy zasilającej. Dodatkowo te komórki karmicielskie wydzielają czynniki wzrostu i syntetyzują białka macierzy zewnątrzkomórkowej, które wspomagają wzrost keratynocytów. W zależności od zdolności proliferacyjnych poszczególnych keratynocytów zaczynają tworzyć kolonie. Usuń pożywkę i napraw kolonie. Wybarwić komórki odpowiednim barwnikiem, aby wykryć kolonie do zliczenia. W poniższym protokole przeprowadzimy test klonogenny pierwotnych keratynocytów pobranych od dorosłych myszy po leczeniu związkami testowymi.

- Po pobraniu próbek skóry grzbietowej od poddanych eutanazji dorosłych myszy, użyj autoklawizowanych kleszczy i skalpela, aby umieścić jedną skórę grzbietową na raz, owłosioną stroną do dołu, na cienkiej szalce Petriego i zeskrobać tkankę podskórną, w tym tłuszcz z brzusznej strony tkanki skórnej, aż tkanka stanie się półprzezroczysta.

Umieść tę zeskrobaną skórkę w PBS, aż wszystkie pozostałe skórki zostaną przetworzone. Następnie za pomocą skalpela pokrój próbki skóry na paski o wymiarach 0,5 x 1 do 1,5 centymetra. Umieść paski włoską stroną do góry na sterylnej szalce Petriego przed uniesieniem próbek włoską stroną do góry na powierzchni 20 mililitrowego roztworu PBS plus 2x gentamycyny uzupełnionego 0,25% trypsyny na plastikowej szalce Petriego o wymiarach 100 x 20 milimetrów na 2 godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umieść sterylną plastikową kwadratową szalkę Petriego zawierającą 15 mililitrów pożywki do zbioru pod kątem 30 stopni i użyj zakrzywionych kleszczy, aby ostrożnie przenieść pływający pasek skóry do naczynia. Trzymając nowe ostrze skalpela pod kątem prostopadłym do skóry i używając wystarczającej, ale nie nadmiernej siły, zeskrobać naskórek i włosy z próbki do podłoża.

Po zeskrobaniu wszystkich pasków ostrożnie zdekantować supernatant zawierający komórki naskórka do sterylnego 60-mililitrowego słoika zawierającego 1,5-calowy magnetyczny pręt mieszający i przepłukać szalkę Petriego dodatkowym podłożem do zbierania, aby zebrać pozostałe komórki naskórka.

Doprowadź końcową objętość w słoiku do 30 mililitrów świeżą pożywką i mieszaj roztwór komórek naskórka z prędkością 100 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji z mieszaniem, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wyjmij mieszadło i przefiltruj roztwór komórkowy przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Użyj kleszczy, a następnie pipety, aby przecisnąć włosy i materiały warstwy rogowej naskórka przez sitko, aby manipulować tkanką, aby uwolnić uwięzione komórki rzęsate, i użyj dodatkowych 5 mililitrów pożywki do pobrania, aby uwolnić pozostałe uwięzione komórki rzęsate do probówki.

- Bardzo ważne jest, aby komórki naskórka i włosy były manipulowane w taki sposób, aby uwolnić komórki z mieszków włosowych.

- Doprowadzić całkowitą objętość w probówce do 50 mililitrów świeżą pożywką i zebrać filtrat komórkowy przez odwirowanie. Zawiesić osad w 5 mililitrach świeżego podłoża do zbioru i około 20 krotnościach za pomocą 5-mililitrowej pipety. Weź 0,5 mililitra rozcieńczenia 1:20 i przenieś go do 2-mililitrowej probówki do mikrofuge.

Po dokładnym wymieszaniu próbki należy pobrać 200 mikrolitrów z probówki do mikrofug i delikatnie wymieszać z równą objętością 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj ten roztwór trzy razy i przenieś komórki do hemacytometru w celu zliczenia jądrzastych keratynocytów.

Oceń wszystkie ciemnoniebieskie komórki jako komórki niezdolne do życia i oscore małe złociste różowawe komórki jako komórki żywotne. Żywotność wynosi średnio około 80%, a ostateczna wydajność keratynocytów na mysz powinna wynosić około 30 milionów żywotnych komórek. Po zliczeniu zbierz komórki za pomocą kolejnego wirowania, a w przypadku hodowli masowej ponownie zawieś 2 do 4 razy 10 do szóstych żywotnych keratynocytów na 35 milimetrów szalki Petriego w 2 mililitrach pożywki do hodowli komórkowych.

W przypadku testu tworzenia kolonii klonogennych, ponownie zawiesić komórki w ilości 1 razy 10 do trzeciego keratynocytu na 4 mililitry zmodyfikowanego podłoża E Williama z suplementami i stężeniem surowicy na pokrytą kolagenem 60-milimetrową szalkę Petriego na napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim warstwach zasilających 3T3 szwajcarskiej myszy.

W przypadku hodowli masowej hoduj kultury w temperaturze 32 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez odpowiedni okres hodowli komórkowej, zmieniając pożywkę 24 godziny po początkowym wysiewie do hodowli masowej i 3 razy w tygodniu po tym.

Pod koniec hodowli klonalnej odessać pożywkę i utrwalić kolonie w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego ranka zabarwić kolonie 0,5% rodaminą B w autoklawowanej wodzie przez godzinę, a następnie spłukać naczynia w zimnej autoklalawowanej wodzie, aż woda będzie czysta. Następnie nachyl naczynia na ich pokrywkach do wyschnięcia przed policzeniem kolonii.