Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

- Podczas testu przeszczepu czerniaka komórki rakowe danio pręgowanego z nowotworem są przeszczepiane do modelu biorcy z obniżoną odpornością w celu zbadania rozwoju guza. Zacznij od pobrania eutanazji dawcy danio pręgowanego i chirurgicznego wycięcia guza z jego ciała. Przenieś guz na szalkę Petriego zawierającą odpowiedni bufor i zmiel go na małe kawałki.

Następnie rozcieraj fragmenty guza za pomocą pipety. To dysocjuje kawałki guza na pojedyncze komórki. Teraz załaduj zawiesinę komórek nowotworowych do strzykawki. Następnie przygotuj danio pręgowanego Casper z obniżoną odpornością na bibule filtracyjnej. Ten zmutowany wariant danio pręgowanego z niedoborem pigmentacji nie ma melanocytów i irydoforów, co czyni go przezroczystym i wszechstronnym do obrazowania i eksperymentów transplantacyjnych.

Następnie wstrzyknąć wstępnie załadowaną zawiesinę komórek czerniaka podskórnie w obszar powyżej jamy otrzewnej, w połowie drogi między tyłomózgowiem a płetwą grzbietową danio pręgowanego Caspera. Teraz przenieś rybę biorcę do wody i monitoruj ją, aby obserwować rozwój guza. Przezroczyste ciało danio pręgowanego pomaga w łatwej wizualizacji rozwiniętych guzów.

W poniższym protokole pokażemy przeszczepienie komórek czerniaka od transgenicznego dawcy danio pręgowanego z nowotworem do biorcy z obniżoną odpornością modelu ryb Casper.

- Po napromieniowaniu biorcy w wieku od 2 do 3 miesięcy Casper napromieniowaniem gamma 25 Gy na dzień przed przeszczepem, należy pozwolić rybie dojść do siebie w wodzie dla ryb. Użyj tricainy do eutanazji ryby z nowotworem. Odetnij guz i umieść go na szalce Petriego z około 5 mililitrami filtra wysterylizowanego 0,9x PBS z 5% FPS. Za pomocą brzytwy pokrój guz w kostkę w roztworze.

Pracując w temperaturze pokojowej i z pipetą P1000, rozcieraj w celu uzyskania pojedynczych komórek. Zwiększ objętość do 25 mililitrów. Przefiltruj roztwór przez filtr siatkowy o wielkości 40 mikrometrów i wiruj w wirówce stołowej przy 453 rcf przez 10 minut. Zawiesić osad w 0,9% PBS 5% FBS do pożądanego stężenia.

Za pomocą hemocytometru oblicz dokładną liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek tak, aby końcowa objętość wstrzyknięcia wynosiła około 5 mikrolitrów. Na przykład, jeśli ma zostać wstrzykniętych 50 000 komórek, zawiesinę komórek należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 000 komórek na mikrolitr. Co kilka minut przesuwaj probówkę zawierającą zawiesinę komórek, aby zapobiec zlepianiu się komórek.

Przy użyciu 100% etanolu i 0,9x PBS umyj strzykawkę Hamilton o rozmiarze 26s (końcówka skośna) 701 N 10 mikrolitrów 2 do 3 razy przed załadowaniem strzykawki 5 mikrolitrami zawiesiny komórek. Po znieczuleniu napromieniowanej ryby biorcy w tricaine, należy położyć ją na boku na wilgotnej chusteczce Kimwipe.

Ustabilizuj rybę jedną ręką i włóż igłę skosem skierowanym do góry pod kątem 45 stopni w bok ryby powyżej jamy otrzewnej, mniej więcej w połowie odległości między tylną granicą tyłomózgowia a wewnętrzną granicą płetwy grzbietowej. Delikatnie wciśnij tłok. Pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie rybnej i codziennie obserwuj ryby pod kątem wszczepienia guza. Jeśli doszło do wszczepienia, można również zaobserwować ciągły wzrost i rozwój choroby.