Name: Rejestrowanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus za pomocą mikrokinematografii poklatkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę mikrokinematografii poklatkowej do badania zachowań rojowych Myxococcus xanthus. Protokół wykorzystuje tanie, wielokrotnego użytku uszczelki silikonowe do utrzymania odpowiedniej wilgotności i natlenienia próbek przez ponad tydzień.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały sfinansowane z grantu National Science Foundation Career award (MCB-0746066, Characterization of Transcriptional Activators that Regulate Emergent Behavior) przyznanego R.D.W.
Jesteśmy wdzięczni L. J. Shimkusowi, B. S. Goldmanowi, G. Suenowi, M. Singerowi, L. G. Welchowi, K. A. Murphy'emu i H. G. Taylorowi za pomocne dyskusje i uwagi do rękopisu.

Wymagane materiały:
<ul>
 <li>Klettometr</li>
 <li>Pipeta i końcówki</li>
 <li>Probówki do mikrocentryfugi 2,5 ml</li>
 <li>Mikrocentryfuga</li>
 <li>Pożywka CTTYE:
 <ul>
 <li>1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% ekstraktu drożdżowego (Difco Laboratories),</li>
 <li>10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH2PO4, 8,0 mM MgSO4</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Pożywka TPM:
 <ul>
 <li>10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH2PO4, 8,0 mM MgSO4</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Agaroza</li>
 <li>Kąpiel wodna ustawiona na 55°C</li>
 <li>Szklane szkiełka przedmiotowe</li>
 <li>Duże szklane szkiełka nakrywkowe</li>
 <li>Uszczelka z gumy silikonowej 2 x 2 cm o grubości 0,5 mm (Grace Bio-Lab Inc.)</li>
 <li>Parafilm (lub taśma etykietująca)</li>
 <li>Pinceta</li>
 <li>Małe żabki biurowe</li>
 <li>Pipeta do mikropróbkowania (Fisher)</li>
 <li>Szklana jednorazowa końcówka 100 μl (Fisher)</li>
 <li>Chusteczki Kimwipes</li>
</ul>
Część 1: Przygotowanie komórek
Zacznij od przygotowania sterylnego środowiska.
<ul>
 <li>Oczyścić stanowisko pracy, założyć rękawiczki i zapalić palnik.</li>
</ul>
<ol>
 <li>Przygotować nocną hodowlę komórek poprzez inokulację do kolby zawierającej bulion CTTYE i inkubację w ciemności w temperaturze 32°C przy intensywnym wytrząsaniu.</li>
 <li>Po osiągnięciu przez hodowlę gęstości 5 x 108 komórek/ml, pipetować 1 ml komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2,5 ml.</li>
 <li>Zwirwić komórki poprzez wirowanie przez 2 min przy 16 000 x g (lub z maksymalną prędkością).</li>
 <li>Odlać i usunąć nadsącz.</li>
 <li>Przemyć osad komórkowy 1 ml TPM (medium zrównoważone solnie, bez składników odżywczych).
 <ul>
 <li>resuspender i wymieszać w wortexie</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Ponownie zwirować komórki przez 2 min przy 16 000 x g (lub z maksymalną prędkością).</li>
 <li>Odlać i usunąć nadsącz. 
 
 KROK KRYTYCZNY 
 
 </li>
 <li>Całkowicie resuspender osad w 100 μl medium TPM, łącząc pipetowanie z mieszaniem w wortexie. 
 
 WAŻNE: Krok ten zapewnia brak skupisk komórek w probówce. Może to zająć trochę czasu.</li>
 <li>Odstawić komórki w temperaturze pokojowej na czas przygotowania płytek do testu śledzenia.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie agaru
<ol>
 <li>Przygotować po 50 ml pożywek TPM (pożywka do testu) i CTTYE (do dysków odżywczych).</li>
 <li>Do każdej z nich dodać 0,5 g agarozy (agaroza wykazuje mniejszą dyfrakcję niż agar).</li>
 <li>Sterylizować w autoklawie.</li>
 <li>Po sterylizacji utrzymywać pożywki w temperaturze 55°C w inkubatorze (lub kąpieli wodnej) podczas przygotowywania kompleksów płytek do testu śledzenia.</li>
</ol>
Część 3: Konstrukcja dysku odżywczego
<ol>
 <li>Umieść sterylną uszczelkę z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm na wierzchu wysterylizowanego nad palnikiem szkiełka przedmiotowego, tworząc niewielki dołek.</li>
 <li>Pipetuj ~300 μl podłoża CTTYE z agarozą o temperaturze 55°C do dołka utworzonego przez uszczelkę na szkiełku zawierającym dysk odżywczy. Podłoże CTTYE z agarozą powinno utworzyć wypukłość.</li>
 <li>Połóż wysterylizowane nad palnikiem szkiełko (bez uszczelki) na wierzchu podłoża CTTYE z agarozą. 
 
 WAŻNE: Szkiełko należy kłaść pod kątem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Po umieszczeniu szkiełka zaciśnij cały zespół za pomocą mini-klipsów biurowych – po jednym z każdej strony.</li>
 <li>Umieść zapięty zespół w temperaturze 4°C i poczekaj, aż podłoże CTTYE z agarozą stężeje. Zazwyczaj trwa to około 5 min.</li>
</ol>
Część 4: Przygotowanie testu śledzenia – przygotowanie kompleksów na płytce
Złożyć komponenty, przygotować kompleksy na szkiełkach, umieścić dysk odżywczy, wlać medium TPM/agarozę, rozdzielić i osuszyć kompleksy płytek, wysiać komórki oraz złożyć kompleksy płytek do testu śledzenia.
Złóż komponenty kompleksu płytki
<ol>
 <li>Dla każdego kompleksu wysterylizuj szkiełko przedmiotowe nad płomieniem</li>
 <li>Umieść autoklawowaną uszczelkę na górze szkiełka i odstaw (stroną sterylną do góry). Będzie ona stanowić dno układu pomiarowego.</li>
 <li>Wysterylizuj nad płomieniem szkiełko nakrywkowe i umieść je na drugim szkiełku przedmiotowym owiniętym taśmą etykietującą (lub Parafilmem), a następnie odstaw (stroną sterylną do góry). Służy ono jako szkiełko wsporcze, aby zapobiec pękaniu nakrywki. Będzie ono stanowić górną część układu pomiarowego.</li>
 <li>Wysterylizuj nad płomieniem trzecie szkiełko przedmiotowe i odstaw (stroną sterylną do góry). Będzie ono służyć do spłaszczania agarozy. 
 
 WAŻNE: Upewnij się, że uszczelki tworzą szczelne połączenie ze szkłem, dociskając je pęsetą; w przeciwnym razie medium/agaroza mogą wyschnąć.</li>
</ol>
Umieść dysk odżywczy
WAŻNE: Kroki od 5 do 10 muszą być wykonywane na jednym kompleksie szkiełek na raz; w przeciwnym razie medium/agaroza mogą zacząć tężeć, co spowoduje niską jakość nagrania.
<ol start="5">
 <li>Wyjąć kompleks dysku odżywczego z temperatury 4°C (krok 5 z części 3) i rozdzielić szkiełka, odsłaniając zastygłe medium CTTYE/agarozę.</li>
 <li>Za pomocą pipety mikrootbiorczej z jednorazową szklaną końcówką 100 μl pobrać „dysk odżywczy” o średnicy 1 mm z opisanego powyżej otworu z medium CTTYE/agarozą i umieścić go w zagłębieniu utworzonym przez uszczelkę na szkiełku nakrywkowym (krok 3 powyżej).</li>
</ol>
Zalewanie płytek
KROK KRYTYCZNY
<ol start="7">
 <li>Pipetuj ~300 μl podłoża TPM/agarozy o temperaturze 55°C do zagłębienia utworzonego przez uszczelkę na szkiełku nakrywce, w którym znajduje się dysk odżywczy. Podłoże TPM/agaroza powinno utworzyć wypukłość. 
 
 KROK KRYTYCZNY</li>
 <li>Umieść wysterylizowane płomieniem szkiełko bez uszczelki (z kroku 3) na wierzchu podłoża TPM/agarozy. 
 
 WAŻNE: Szkiełko należy kłaść pod kątem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. 
 
 </li>
 <li>Po umieszczeniu szkiełka (z kroku 5) zaciśnij cały kompleks za pomocą mini-klipsów biurowych – po jednym z każdej strony.</li>
 <li>Umieść zaciśnięty kompleks w temperaturze 4°C i pozostaw podłoże/agarozę do zastygnięcia. Zazwyczaj trwa to około 5 min.</li>
</ol>
Rozdzielenie i osuszenie płytek
WAŻNE: Aby zapobiec wysychaniu podłoża/agarozy, kroki od 11 do 20 należy wykonywać tylko na jednym kompleksie slajdków jednocześnie. 
 
 WAŻNE: Dla uzyskania najlepszych wyników kroki od 11 do 13 należy przeprowadzić w temperaturze 4°C.
<ol start="11">
 <li>Po zastygnięciu medium/agarozy należy zdjąć żabki biurowe i ścisnąć koniec kompleksu, aby poluzować szkiełko owinięte taśmą.</li>
 <li>Należy wyjąć szkiełko owinięte taśmą i położyć je na blacie do dalszego użytku. 
 
 KROK KRYTYCZNY</li>
 <li>Używając pęsety jako klin, należy oddzielić kompleks szkiełka nakrywkowego/uszczelki/medium/agarozy od szkiełka podpierającego (bez uszczelki), a następnie wyrzucić szkiełko podpierające. 
 
 WAŻNE: Nie należy używać ruchu dźwigniowego do oddzielania kompleksu szkiełka nakrywkowego/uszczelki. Może to doprowadzić do pęknięcia szkiełka nakrywkowego i/lub przyklejenia się medium/agarozy do szkiełka podpierającego.</li>
 <li>Należy położyć kompleks szkiełka nakrywkowego/uszczelki/medium/agarozy na szkiełku owiniętym taśmą (stroną uszczelki do góry) i wyjąć z temperatury 4°C. Kompleks ten należy umieścić obok palnika, aby pozwolić na odparowanie całej widocznej wilgoci z nowo odsłoniętej powierzchni medium/agarozy – nie dłużej niż 1 min. 
 
 WAŻNE: Nie wolno dopuścić do zbyt długiego wysychania medium/agarozy, ponieważ może to wpłynąć na zachowanie roju M. xanthus.</li>
</ol>
Wysianie komórek
KROK KRYTYCZNY
<ol>
 <li>Po odparowaniu nadmiaru wilgoci, nanieś pipetą 0,5 μl skoncentrowanych komórek (krok 8 z części 1) na podłoże/agarozę w odległości około 1 mm od dysku z substancjami odżywczymi. 
 
 WAŻNE: Niezwykle ważne jest, aby komórki nanosić, poruszając pipetą pionowo w dół, a następnie pionowo w górę. Zapewnia to okrągły kształt roju. 
 
 WAŻNE: Niezwykle ważne jest, aby nie dotykać końcówki pipety do podłoża/agarozy. Spowoduje to powstanie wgłębienia na powierzchni i zmieni zachowanie roju M. xanthus. 
 
 WSKAZÓWKA: Naciśnij końcówkę pipety przed zbliżeniem jej do podłoża/agarozy. Dzięki temu na spodzie końcówki pipety pojawi się kropla komórek, co ułatwi ich naniesienie.</li>
 <li>Po naniesieniu komórek umieść zestaw obok palnika, aby plamka z komórkami wyschła – nie dłużej niż przez 20 sec.</li>
</ol>
Przygotowanie testu
<ol>
 <li>Po wyschnięciu plamki z komórkami, dopasuj zespół szkiełko/uszczelka (z kroku 1) do uszczelki w zespole szkiełko nakrywkowe/uszczelka/medium/agaroza/komórki (z kroku 13) i delikatnie dociśnij, aby utworzyć szczelne połączenie. 
 
 KROK KRYTYCZNY</li>
 <li>Oczyść powierzchnie szkiełka i nakrywki za pomocą chusteczki Kimwipe, aby usunąć pozostałości Parafilmu. Gotowy układ do analizy powinien wyglądać jak na Rysunku 1.</li>
 <li>Bezpośrednio po przetarciu (krok 15), umieść gotowy zespół szkiełek na podgrzewanym stoliku ustawionym na 32°C (szkiełko na dole, nakrywka na górze), aby zapobiec skraplaniu się pary wodnej. Jeśli pojawiła się kondensacja, pozostaw zespół szkiełek na podgrzewanym stoliku przez kilka sekund przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji obrazu.</li>
 <li>Wybierz odpowiedni obiektyw (2X, 4X lub 10X).</li>
</ol>
Część 5: Przygotowanie filmu
KROK KRYTYCZNY
<ol>
 <li>Włącz kamerę oraz mikroskop i sprawdź poziom oświetlenia (upewnij się, że światło nie jest zbyt intensywne). Uruchom komputer i otwórz program do akwizycji obrazu.</li>
 <li>Kliknij w oknie obrazu na żywo i ustaw ostrość mikroskopu. Obraz powinien być zbliżony do widocznego na Rysunku 3. Zwróć uwagę na jednorodną powierzchnię agaru.</li>
 <li>Rozpocznij akwizycję obrazów. 
 
 KROK KRYTYCZNY</li>
 <li>Regularnie sprawdzaj ostrość podczas pierwszej godziny, ponieważ podłoże/agar ma tendencję do osiadania, co powoduje rozregulowanie ostrości.</li>
 <li>Uporządkuj stanowisko pracy.</li>
 <li>Po zakończeniu akwizycji obrazów przenieś je do pamięci trwałej, a następnie rozdziel zestaw preparatu poprzez namaczanie w 90% etanolu przez noc.</li>
 <li>Zautoklawuj uszczelki w celu ich ponownego wykorzystania.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="Układ wzrostu komórek na agarze, schemat dwóch konstrukcji komór do hodowli komórkowej z uszczelkami i przestrzenią powietrzną." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schematyczny rysunek kompleksu płytki TM. (A) przedstawia podstawowy kompleks płytki TM w widoku rozstrzelonym i w przekroju. (B) przedstawia zastosowanie większych uszczelek.
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="Schemat sieci mikroskopowej; układ optyczny do zintegrowanej komputerowo analizy, rejestracji obrazów i badań." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Klaster mikroskopowy. Każdy węzeł mikroskopowy (wstawka) składa się z mikroskopu Nikon E400, obiektywów, grzanego stolika, kamery Insight oraz laptopa. Każdy węzeł jest połączony w sieć i sprzężony z komputerem sterującym. Dwa z węzłów zostały wyposażone w funkcje fluorescencyjne, na które składają się źródło światła EXFO oraz dwa migawki Uniblitz.
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="Komórka pod mikroskopem; obraz mikroskopowy struktury komórkowej; badanie biologiczne; mikroskopia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Obraz z 20-krotnym powiększeniem aparatury do testu śledzenia w czasie t = 0. Pasek skali, 1 mm.
<img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="Interakcja plemników, etapy zapłodnienia A-D, obraz mikroskopowy przedstawiający proces komórkowy pod mikroskopem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Adaptacyjność kompleksu płyty TM. (A) obraz przy powiększeniu 100X przedstawiający ruch ślizgowy M. xanthus na podłożu CTTYE z 1,0% agarem. (B) obraz przy powiększeniu 20X przedstawiający ruch drgający P. aeruginosa. (C) obraz przy powiększeniu 20X przedstawiający ruch rojący S. marcescens. Oba testy (B) i (C) przeprowadzono na podłożu LB z 1,0% agarem. (D) obraz przy powiększeniu 40X przedstawiający ruch poślizgowy M. smegmatis na podłożu LB z 0,5% agarem. Obraz ten został wykonany przy użyciu alternacyjnej konfiguracji testowej przedstawionej na Ryc. 1B.
Wideo 1. Film poklatkowy przedstawiający rój poddany testowi śledzenia.
Film 2. Film poklatkowy roju M. xanthus, w którym 1% komórek jest znakowanych fluorescencyjnie. Naprzemiennie rejestrowano obrazy w kontraście fazowym i fluorescencyjne, a następnie nakładano je na siebie, aby wyjaśnić położenie komórek fluorescencyjnych w obrębie roju. Film ten został zarejestrowany na podłożu CTTYE z 1,0% agarem.
Wideo 3. Film poklatkowy przedstawiający ruch ślizgowy M. xanthus. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu CTTYE z 1,0% agarem.
Wideo 4. Film w przyspieszonym tempie przedstawiający ruchy typu twitching P. aeruginosa. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu LB z 1,0% agarem.
Wideo 5. Film poklatkowy przedstawiający ruchy swarmingowe S. marcescens. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu LB z 1,0% agarem.
Wideo 6. Film poklatkowy przedstawiający ruch ślizgowy M. smegmatis. Wideo zostało zarejestrowane na podłożu LB z 0,5% agarem, przy użyciu alternacyjnej konfiguracji testu pokazanej na rys. 1B.

<ol><li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li>
<li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li>
<li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li>
<li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+surface+migration%2C+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
<li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li>
<li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li>
<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Mikrocinematografia poklatkowa (TM) stała się standardową metodą badania ruchliwości prokariotów 2-7. Tradycyjnie TM wykonuje się, wykorzystując w jakość podłoża knoty z papieru filtracyjnego, cienkie podkładki agarowe lub płyty agarowe 8-11. Metody te są wystarczające i efektywne kosztowo, gdy są stosowane do generowania sekwencji obrazów służących jako ogólne ilustracje ruchu bakterii. Jednakże, jeśli sekwencje obrazów mają służyć do generowania powtarzalnych i ilościowo rygorystycznych danych, me...

<table><tbody><tr><td>1,0% Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% ekstraktu drożdżowego</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta do mikropróbkowania</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa szklana końcówka 100 &amp;mu;l</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa uszczelka gumowa 2 x 2 cm o grubości 0,5 mm</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Rój δ-proteobakterii Myxococcus xanthus składa się z milionów komórek działających jako kolektyw, które koordynują ruch poprzez serię sygnałów, tworząc złożone, dynamiczne wzorce w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Wzorce te są samoorganizujące się i emergentne; nie można ich przewidzieć, obserwując zachowanie pojedynczych komórek. Wykorzystując test śledzenia za pomocą mikrocinematografii poklatkowej, zidentyfikowaliśmy w M. xanthus wyraźny wzorzec emergentny zwany chemotaksją, zdefiniowaną jako ukierunkowany ruch roju w górę gradientu składników odżywczych w stronę ich źródła 1.
Aby efektywnie charakteryzować chemotaksję za pomocą mikrocinematografii poklatkowej, opracowaliśmy wysoce modyfikowalny zespół płytek (Rysunek 1) i zbudowaliśmy klaster 8 mikroskopów (Rysunek 2), z których każdy jest zdolny do rejestrowania filmów poklatkowych. Analiza ta jest na tyle rygorystyczna, że pozwala na spójną replikację mierzalnych danych, a uzyskane filmy umożliwiają obserwację i śledzenie subtelnych zmian w zachowaniu roju. Po zarejestrowaniu filmy są przenoszone na komputer do analizy i przechowywania, który posiada wystarczającą pamięć do przetwarzania i archiwizowania tysięcy nagrań. Elastyczność tej konfiguracji okazała się przydatna dla wielu członków społeczności badającej M. xanthus.

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Rój $\delta$-proteobakterii Myxococcus xanthus składa się z milionów komórek, które działają jako kolektyw, koordynując ruch poprzez serię...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest opracowanie taniej metody mikrocinematografii time-lapse o wystarczającej precyzji, aby generować powtarzalne i mierzalne wyniki. Osiągnięto to poprzez zastosowanie niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych do konstrukcji płytek z pożywką agarową lub szkiełek przedmiotowych. Uzyskane wyniki wykazują, że kompleksy płytek tych pozostają nawilżone i dostatecznie natlenione przez ponad tydzień w różnych typach pożywek i przy różnych stężeniach agaru.Dodatkowo, ponieważ mikrocinematografia z odstępami czasu jest procesem powolnym, zastosowanie ośmiu niedrogich mikroskopów pomaga przyspieszyć akwizycję danych. Witam, nazywam się Ryan Taylor i reprezentuję laboratorium dr. Roya Welcha z Katedry Biologii na Uniwersytecie Syracuse. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia filmów poklatkowych z biofilmów bakteryjnych; w naszym laboratorium wykorzystamy tę procedurę do badania wielokomórkowego zachowania biofilmów MTIs.Zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, zmierz gęstość komórek w kulturze Occus sanus namnożonej przez noc za pomocąt mierzaka CLUT. Przenieś 1 mL kultury do probówki wirówkowej o pojemności 2,5 mL, a następnie odwirowuj, przemyj i resuspenduj bakterie w medium TPM, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Użyj pipety i wierzchołka do całkowitego resuspendowania osadu, co może zająć pewien czas. Następnie dodaj 0,5 g aros do 50 mL TPM, które służy jako medium do analizy.Należy również dodać 0,5 grama agaru do 50 mililitrów pożywki C-T-T-Y-E, która jest pożywką do dysków odżywczych, a następnie wysterylizować ją w autoklawie. Następnie utrzymać pożywkę w temperaturze 55 °C w inkubatorze lub kąpieli wodnej podczas przygotowywania testu śledzenia.Kompleksy płytek są przygotowywane poprzez najpierw sterylizację szkiełka przedmiotowego w płomieniu palnika. Należy położyć na szkiełku sterylną uszczelkę z gumy silikonowej o grubości 0,5 mm. Za pomocą pipety nanieś około 300 µl pożywki C TT YE do zagłębienia utworzonego przez uszczelkę na szkiełku.Po sterylizacji płomieniem kolejnego szkiełka przedmiotowego, należy położyć je pod kątem na pożywce C-T-T-Y-E. Umieszczenie szkiełka pod kątem zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza. Gdy szkiełko znajdzie się na miejscu, należy połączyć oba elementy za pomocą małych żabek biurowych, umieszczając jedną po każdej stronie.Umieść przycięty kompleks w temperaturze czterech stopni Celsjusza i poczekaj, aż podłoże C-T-T-Y-E agro zastygnie. Zazwyczaj zajmuje to około pięciu minut. Po zastygnięciu agro można przygotować kompleksy płytek wykorzystywane w teście śledzenia.Rozpocznij od przygotowania szkiełek do budowy kompleksów testowych. Dla każdego kompleksu wysterylizuj płomieniem dwa szklane szkiełka przedmiotowe. Na jedno z szkiełek połóż uszczelkę autoklawu, aby stworzyć podstawę testu.Drugie szkiełko służy do spłaszczania agrosów oraz jako szkiełko podpierające. Górną część układu testowej stanowi szkiełko nakrywka. Najpierw owiń szkiełko przedmiotowe taśmą do etykietowania, następnie wysterylizuj szkiełko nakrywkę w płomieniu i umieść je na wierzchu wysterylizowanego, owiniętego szkiełka.Przesuń w górę owinięte podpórki do szkiełek, które podtrzymują szkiełko nakrywkę, chroniąc ją przed pęknięciem. Za pomocą pęsety umieść uszczelkę do autoklawu na sterylizowanym płomieniem szkiełku nakrywce. Dociśnij uszczelki na dolnym szkiełku oraz na szkiełku nakrywce, aby upewnić się, że tworzą one szczelne połączenie ze szkłem.W przeciwnym razie pożywki w matrycach mogą wyschnąć. Odstaw zestawy uszczelek do szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych stroną sterylną do góry; od tego momentu pracuj tylko nad jednym kompleksem na raz, aby zapobiec zestaleniu się pożywek, co mogłoby pogorszyć jakość filmu. Rozpocznij od umieszczenia dysku odżywczego.Wyjmij kompleks dysków odżywczych z temperatury czterech stopni Celsjusza. Zdejmij osłonę i delikatnie oddziel preparaty, pobierając teraz zestalone agar C-T-T-Y-E za pomocą pipety mikrosamplującej z jednorazową szklaną końcówką 100 µL. Wycinaj dysk odżywczy o średnicy 1 mm z agaru C-T-T-Y-E i umieść go w wgłębieniu utworzonym przez uszczelkę na szkiełku nakrywce.Następnie należy wyjąć podkładki z pożywką TPM z inkubatora i pipetować 300 µl do zagłębienia utworzonego przez uszczelkę na szkiełku nakrywce, w którym znajduje się dysk odżywczy. Pożywka TPM w podkładce powinna utworzyć wypukłość, aby wyrównać powierzchnię pożywki T-P-M-S-A. Jedno ze szkiełek sterylizowanych płomieniem i pozbawionych uszczelki należy położyć pod kątem na wierzchu podkładki z pożywką TPM. Ułożenie szkiełka pod kątem pomaga zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.Zaciśnij kompleks za pomocą miniaturowych ż Conversely klipsów biurowych, umieszczając po jednym z każdej strony. Umieść zaciśnięty kompleks w temperaturze 4 °C i poczekaj, aż medium agarowe stężeje. Zazwyczaj zajmuje to około pięciu minut.Po zastygnięciu podłoża agarowego wyjmij kompleks z temperatury 4°C. Zdejmij żabki biurowe i ściśnij koniec kompleksu. Aby poluzować owinięty taśmą szkiełko, wyjmij je i połóż na blacie do dalszego użytku.Następnie, używając pęsety jako klina, oddziel zespół uszczelki szkiełka nakrywkowego i matrycy od szkiełka podporowego, a następnie zutylizuj szkiełko podporowe. Nie należy używać ruchu dźwigniowego przy oddzielaniu zespołu uszczelki i szkiełka nakrywkowego, ponieważ może to doprowadzić do stłuczenia szkiełka nakrywkowego i/lub przywarcia matrycy do szkiełka podporowego.Po usunięciu lamellki wspierającej, umieść kompleks macierzy mediów z uszczelką lamellki na szkiełku owiniętym taśmą, stroną z uszczelką do góry. Umieść ten kompleks obok palnika, aby umożliwić odparowanie całej widocznej wilgoci z nowo odsłoniętej powierzchni media agros. Nie dopuszczaj do wysychania media agros przez czas dłuższy niż jedna minuta.Ponieważ może to wpłynąć na zachowanie roju M Zant, należy przystąpić do wysiewania komórek na nowo przygotowany kompleks analityczny. Po odparowaniu nadmiaru wilgoci z podłoża kompleksu agros uszczelki szkiełka nakrywkowego, należy pobrać 0,5 µL skoncentrowanych komórek w celu ich naniesienia na podłoże. Przed zbliżeniem się do agros podłoża należy zwolnić nacisk końcówki pipety.Na końcówce pipety pojawia się kropla zawiesiny komórek, co ułatwia ich naniesienie bez dotykania końcówką powierzchni agaru. Wgniecenie na powierzchni agaru może zmienić zachowanie roju mz. Przesuń pipetę pionowo w dół, aby wydać komórki w odległości około jednego milimetra od zatopionego dysku odżywczego.Następnie pionowo wycofaj pipetę. W ten sposób zapewnia się, że rozkład komórek ma kształt koła. Po naniesieniu komórek umieść kompleks obok palnika, aby pozwolić plamce z komórkami wyschnąć przez nie więcej niż 20 sekund.Po wysuszeniu dopasuj zespół uszczelki do szkiełka, tworzący dno kompleksu, do uszczelki na pokrywie. Wsuń nośnik uszczelki acro cell complex, tworzący górną część kompleksu. Delikatnie dociśnij elementy, aby utworzyć szczelne połączenie.Przetrzyj powierzchnie szkiełka i nakrywki za pomocą chusteczki Kimwipe, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i zapobiec kondensacji. Bezpośrednio po oczyszczeniu szkiełek umieść preparat na podgrzewanym stoliku mikroskopu, kładąc szkiełko na dół, a nakryvkę do góry. Jeśli utworzyła się kondensacja, pozostaw preparat na podgrzewanym stoliku przez kilka sekund przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji obrazów.Aby przygotować film, wybierz odpowiedni obiektyw mikroskopu: 2x, 4x lub 10x. Włącz kamerę oraz mikroskop i sprawdź poziom oświetlenia, aby upewnić się, że światło nie jest zbyt intensywne. Uruchom komputer i otwórz program do akwizycji obrazu.Kliknij okno obrazu na żywo i ustaw ostrość mikroskopu. Obraz powinien być podobny do przedstawionego tutaj. Rozpocznij akwizycję obrazów.Należy regularnie sprawdzać ostrość w ciągu pierwszej godziny, ponieważ agar w pożywce ma tendencję do osiadania, co powoduje przesunięcie płaszczyzny ogniskowania. Po zakończeniu akwizycji obrazów należy przenieść pozyskane pliki do pamięci magazynowej. Rozmontuj zespół szkiełek, mocząc go przez noc w 90% etanolu lub wyczyść uszczelki za pomocą TOLA w celu ich ponownego użycia.Ten film poklatkowy przedstawia em poddane opisanemu tutaj testowi śledzenia. Szybkość rejestracji wynosi jeden obraz na minutę przy powiększeniu 20 x, a szybkość odtwarzania to 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy przedstawia populację eant the cells, w której 1% komórek wykazuje ekspresję GFP.Film został stworzony poprzez scalenie naprzemiennych obrazów z kontrastu fazowego i obrazów fluorescencyjnych. Analizę przeprowadzono na C-T-T-Y-E w 1%Aros; szybkość akwizycji wynosi jeden obraz na minutę przy powiększeniu 100 x. Ten film poklatkowy przedstawia ruch ślizgowy M Anthes.Ten test przeprowadzono na C-T-T-Y-E w 1%Aros; szybkość rejestracji obrazów wynosi jedna klatka na minutę przy powiększeniu 100 x. Ten film TimeLapse przedstawia ruchy drgające (twitching motility) P OSA. Ten test przeprowadzono na LB w 1%Aros; szybkość rejestracji obrazów wynosi jedna klatka na minutę.Przy powiększeniu 20x szybkość odtwarzania wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy przedstawia motylność rojącą w odpowiedzi na Smar. Analizę przeprowadzono na podłożu LB i 1% Aris, a częstotliwość rejestracji obrazów wynosi jeden obraz na minutę.Przy powiększeniu 20x prędkość odtwarzania wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy przedstawia ruch poślizgowy EGT. Analizę tę przeprowadzono na LB w 0,5%Tag szybkość przechwytywania wynosi jeden obraz na minutę, a przy powiększeniu 20x prędkość odtwarzania wynosi 120 obrazów na sekundę ze względu na kruchość 0,5%arose w lv.W tym teście wykorzystuje się większe uszczelki pokazane na rysunku 1B. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób generowania filmów time-lapse z biofilmów bakteryjnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie spieszyć się i być jak najdokładniejszym, aby uzyskać spójne wyniki.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestrowanie zachowania wielokomórkowego w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocınematygrafii time-lapse

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Źródło: Oms, T., et al. Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)Ten film przedstawia protokół monitorowania poszczególnych komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję znakowanego fluorescencyjnie białka wiążącego DNA w układzie mikroprzepływowym. Ilustruje to, w jaki sposób antybiotyki hamują większość komórek, podczas gdy subpopulacja komórek przetrwałych przeżywa leczenie i odrasta po usunięciu antybiotyku.

Mikroprzepływowa mikroskopia poklatkowa do badania trwałości antybiotyków w bakteriach

Źródło: Schumacher, D. i in. Obrazowanie żywymi komórkami fluorescencji pełnego cyklu komórkowego wegetatywnego powoli rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie Myxococcus xanthus, powoli rosnącej bakterii glebowej. Hodowla jest uprawiana w podłożu, nakładana na pokrywę fluorescencyjnych mikrosfer i nakładana na podgrzaną agarozę, aby wspierać nawodnienie i dopływ składników odżywczych. Takie rozwiązanie umożliwia...

Przygotowanie próbek Myxococcus xanthus do obrazowania żywymi komórkami

Źródło: Schumacher, D., i Sogaard-Andersen, L. Obrazowanie żywymi komórkowymi fluorescencji pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje wykorzystanie obrazowania żywych komórek do śledzenia pochodzenia chromosomów oznaczonych fluorescencją podczas podziału komórek bakteryjnych. Rejestruje dynamikę segregacji chromosomów za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej oraz fluorescencji.

Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Źródło: Makowski, Ł., i in. Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życia bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne Bdellovibrio bacteriovorus polującego na unieruchomionej E. coli pod agarozową poduszką, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym replikacji wewnątrzkomórkowej i uwalniania potomstwa do badania drapieżnictwa bakteryjnego i interakcji...

Obrazowanie czasowe z żywymi komórkami drapieżnictwa bakterioworu Bdellovibrio na E. coli

Mikroreologia śledząca cząstki bada lepkosprężystość materiałów. W tym przypadku technika ta jest wykorzystywana do określania lepkosprężystości, podatności pełzania i efektywnych ról sieciowania różnych składników matrycy biofilmu bakteryjnego. Matryca składa się z substancji polimerowych wydzielanych przez bakterie, a jej składniki decydują o budowie biofilmu i właściwościach mechanicznych.

In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

W tym badaniu, nano-mikroprzepływowa komora przepływowa została wykorzystana do wizualizacji i funkcjonalnego scharakteryzowania drgań Xylella fastidiosa, bakterii wywołującej chorobę Pierce'a u winorośli.

Wizualizacja ruchliwości drgań i charakterystyka roli PilG u Xylella fastidiosa

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Poznaj metodę mikrokinematografii poklatkowej do badania zachowań rojowych Myxococcus xanthus. Protokół wykorzystuje tanie, wielokrotnego użytku uszczelki silikonowe do utrzymania odpowiedniej wilgotności i natlenienia próbek przez ponad tydzień.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Przeglądaj więcej filmów