Rejestrowanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus za pomocą mikrokinematografii poklatkowej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie taniego testu mikrokinematografii poklatkowej o wystarczającym rygorze, aby uzyskać powtarzalne i policzalne wyniki. Osiąga się to dzięki zastosowaniu niedrogich uszczelek silikonowych wielokrotnego użytku do budowy płytek agros lub szkiełek mikroskopowych. Uzyskano wyniki, które pokazują, że te kompleksy płytek pozostają uwodnione i wystarczająco natlenione przez ponad tydzień przy różnych typach pożywek i stężeniach agaru.

Ponadto, ponieważ mikrokinematografia poklatkowa jest powolnym procesem, użycie ośmiu niedrogich mikroskopów pomaga przyspieszyć pozyskiwanie danych. Cześć, nazywam się Ryan Taylor i pracuję w laboratorium dr Roya Welcha z Wydziału Biologii Uniwersytetu w Syracuse. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę tworzenia filmów poklatkowych biofilmów bakteryjnych w naszym laboratorium, użyjemy tej procedury do zbadania wielokomórkowego zachowania biofilmów MTIs.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć tę procedurę, zmierz gęstość komórek nocnej mieszanki Occus sanus za pomocą glukometru, przenieś jeden mililitr kultury do 2,5-mililitrowej probówki wirówkowej, przepłucz i ponownie zawieś bakterie w pożywce TPM, jak opisano w dołączonym pisemnym protokole, pipetę i wir, aby całkowicie zawiesić osad, co może chwilę potrwać. Następnie dodaj 0,5 grama aros do 50 mililitrów TPM, który jest pożywką testową.

Dodaj również 0,5 grama aros do 50 mililitrów C-T-T-Y-E, który jest autoklawem z odżywczą pożywką do sterylizacji. Następnie utrzymuj pożywkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza w inkubatorze lub łaźni wodnej. Podczas konstruowania testu śledzenia.

Kompleksy płytek przystępują do budowy szklanego mikroskopu ze sterylizatorem z pierwszym płomieniem z dyskiem odżywczym. Przesuń i umieść sterylną uszczelkę z gumy silikonowej o grubości 0,5 milimetra na górze szkiełka. Pipety o objętości około 300 mikrolitrów pożywki C TT YE są wprowadzane do studzienki utworzonej przez uszczelkę na szkiełku.

Nośnik C-T-T-Y-E powinien wzniecić płomienie, wysterylizować kolejny szkiełko i ustawić go pod kątem na górze nośnika C-T-T-Y-E. Ustawienie suwaka pod kątem zapobiega tworzeniu się pęcherzyków. Gdy szkiełko znajdzie się na miejscu, wypełnij kompleks za pomocą mini klipsów do segregatora, po jednym z każdej strony.

Umieść przycięty kompleks w temperaturze czterech stopni Celsjusza i poczekaj, aż nośnik agro C-T-T-Y-E zastygnie. Zwykle zajmuje to około pięciu minut. Po ustawieniu agro można przygotować kompleksy płytek używane w teście śledzenia.

Zacznij od przygotowania szkiełek do budowy kompleksów testowych. Dla każdego złożonego płomienia sterylizowane są dwa szklane szkiełka mikroskopowe. Umieść uszczelkę autoklawu na jednym ze szkiełek, aby utworzyć spód testu.

Druga zjeżdżalnia służy do spłaszczania agros oraz jako zjeżdżalnia podporowa. Górną częścią testu jest szkiełko nakrywkowe. Najpierw owiń szkiełko mikroskopowe taśmą do etykietowania, a następnie szklaną szkiełko nakrywkowe sterylizatora płomieniowego i umieść je na owiniętym szkiełku wysterylizowanym.

Przesuń owiniętą szkiełko w górę, podtrzymując szkiełko nakrywkowe, zapobiegając jego pękaniu. Umieść uszczelkę autoklawu na sterylizowanym płomieniowo szkiełku nakrywkowym za pomocą kleszczyków. Dociśnij uszczelki na dolnym suwaku i szkiełku nakrywkowym, aby upewnić się, że tworzą uszczelkę ze szkłem.

W przeciwnym razie nośniki z tablicami mogą wyschnąć. Odłóż na bok uszczelkę suwaka i uszczelkę szkiełka pokrywy sterylizowanymi stronami do góry, pracuj tylko na jednym kompleksie na raz, aby zapobiec zestalaniu się nośnika, co skutkowałoby niską jakością filmu. Zacznij od umieszczenia krążka odżywczego.

Usuń odżywczy kompleks krążków z czterech stopni Celsjusza. Usuń zaćmienie wiązania i wcześniejszą część szkiełek, odsłaniając teraz zestalony układ C-T-T-Y-E za pomocą pipety do mikropobierania próbek z jednorazową końcówką ze szkła o pojemności 100 mikrolitrów. Z podłoża agro C-T-T-Y-E należy również wyjąć krążek odżywczy o średnicy jednego milimetra i umieścić go w studzience utworzonej przez uszczelkę na szkiełku nakrywkowym.

Następnie pobrać pożywkę TPM agros z inkubatora i pipetować 300 mikrolitrów do studzienki utworzonej przez uszczelkę na szkiełku nakrywkowym i zawierającej krążek odżywczy. Media TPM Agros powinny usypać się, aby spłaszczyć medium T-P-M-S-A Umieść jeden z wysterylizowanych płomieniowo szkiełek bez uszczelki pod kątem na górze nośnika TPM. Umieszczenie szkiełka pod kątem pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków.

Zaciśnij kompleks razem za pomocą mini spinaczy do segregatorów, po jednym z każdej strony. Umieść przycięty kompleks w temperaturze czterech stopni Celsjusza i pozwól, aby powstałe podłoże stężało. Zwykle zajmuje to około pięciu minut.

Gdy podłoże wyrośnie, należy usunąć kompleks z czterech stopni Celsjusza. Usuń spinki do segregatora i ściśnij koniec kompleksu. Aby poluzować prowadnicę owiniętą taśmą, zdejmij szkiełko owinięte taśmą i umieść je na stole do dalszego użycia.

Następnie użyj pary kleszczy jako klina. Oddzielić kompleks agros uszczelniający uszczelkę szkiełka nakrywkowego od szkiełka nośnego i wyrzucić suwak nośny. Nie należy używać ruchu podważającego w celu oddzielenia kompleksu uszczelek szkiełek pokrywy, ponieważ może to spowodować pęknięcie szkiełka nakrywkowego i/lub przyklejenie się nośnika do suwaka nośnego.

Po zdjęciu suwaka nośnego umieść kompleks uszczelek szkiełek nakrywkowych na prowadnicy owiniętej taśmą uszczelką do góry. Umieść ten kompleks obok palnika, aby cała widoczna wilgoć odparowała z nowo odsłoniętej powierzchni podłoża agros. Nie pozwól, aby podłoże wyschło dłużej niż jedną minutę.

Ponieważ może to mieć wpływ na zachowanie roju M Zant, przystąp do płytki komórek na nowo przygotowanym kompleksie testowym. Po odparowaniu nadmiaru wilgoci z pożywki uszczelniającej preparat nakrywkowy agros complex należy zassać 0,5 mikrolitra skoncentrowanych komórek do osadzania na podłożu. Aeros wciska końcówkę pipety przed zbliżeniem się do podłoża agros.

Na dnie końcówki pipety pojawia się kropla komórek, co ułatwia osadzanie komórek bez dotykania końcówki podłoża. Zagłębienie na powierzchni agros może zmienić zachowanie roju mz. Przesuń pipetę prosto w dół, aby dozować komórki w odległości około jednego milimetra od osadzonego krążka odżywczego.

Następnie pociągnij pipetę prosto do góry. W ten sposób upewnia się, że rój jest okrągły. Po osadzeniu komórek umieść kompleks obok palnika, aby komórki wyschły nie dłużej niż 20 sekund.

Po wyschnięciu wyrównaj zespół uszczelki ślizgowej tworzący dno kompleksu z uszczelką na pokrywie. Kompleks komórek acro z uszczelką poślizgową tworzący górną część kompleksu. Delikatnie dociśnij do siebie, aby utworzyć uszczelkę.

Oczyść powierzchnie szkiełka w szkiełku nakrywkowym chusteczką do szkiełka nakrywkowego, aby usunąć wszelkie pozostałości i zapobiec kondensacji. Umieść kompleks na podgrzewanym stoliku mikroskopowym natychmiast po oczyszczeniu szkiełek z szkiełkiem w dół i wsunięciem pokrywy do góry. Jeśli doszło do kondensacji, pozostaw kompleks szkiełek na podgrzewanej scenie na kilka sekund przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji obrazu.

W celu przygotowania filmu należy wybrać odpowiedni obiektyw, dwa x cztery x lub 10 x na mikroskopie. Włącz aparat i mikroskop i sprawdź poziom światła, aby upewnić się, że światło nie jest zbyt intensywne. Uruchom komputer i otwórz program do pozyskiwania obrazów.

Kliknij okno obrazu na żywo i ustaw ostrość mikroskopu. Obraz wygląda podobnie do pokazanego tutaj. Zacznij zbierać obrazy.

Upewnij się, że regularnie sprawdzasz ostrość w ciągu pierwszej godziny, ponieważ agar z podłożem ma tendencję do osiadania, powodując dryf ostrości. Po zakończeniu akwizycji obrazu prześlij uzyskane obrazy do przechowywania. Rozbij kompleks zjeżdżalni, mocząc uszczelki w 90% etanolu przez noc lub TOLA uszczelki do ponownego użycia.

Ten film poklatkowy pokazuje je poddane opisanemu tutaj testowi śledzenia. Szybkość przechwytywania wynosi jeden obraz na minutę przy powiększeniu 20x, szybkość odtwarzania wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy pokazuje populację komórek, w których 1% komórek wykazuje ekspresję GFP.

Film został zmontowany poprzez połączenie naprzemiennych kontrastów fazowych i obrazów fluorescencyjnych. Test przeprowadzono na C-T-T-Y-E w 1% Szybkość przechwytywania Aros to jeden obraz na minutę w powiększeniu 100 x. Ten film poklatkowy pokazuje ruchliwość szybującą M Anthes.

Test ten przeprowadzono na C-T-T-Y-E w 1% Szybkość przechwytywania Aros wynosi jeden obraz na minutę przy powiększeniu 100 x. Ten film TimeLapse pokazuje drgającą ruchliwość P OSA. Ten test przeprowadzono na LB w 1% Szybkość przechwytywania Aros wynosi jeden obraz na minutę.

Przy powiększeniu 20-krotnym odtwarzanie wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy pokazuje Smar wyczuwa ruchliwość roju. Ten test został przeprowadzony na LB, a szybkość przechwytywania 1% Aris wynosi jeden obraz na minutę.

Przy powiększeniu 20-krotnym odtwarzanie wynosi 60 obrazów na sekundę. Ten film poklatkowy pokazuje ruchliwość ślizgową EGT. Ten test został przeprowadzony na LB w 0,5% Szybkość przechwytywania róży tagów wynosi jeden obraz na minutę, ponieważ powiększenie 20-krotne odtwarzanie wynosi 120 obrazów na sekundę ze względu na kruchość 0,5% powstała w lv.

Ten test wykorzystuje większe uszczelki widoczne na rysunku pierwszym B. Właśnie pokazaliśmy, jak generować filmy poklatkowe biofilmów bakteryjnych. Podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby nie spieszyć się i być tak precyzyjnym, jak to tylko możliwe, aby osiągnąć spójne wyniki.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.