Name: Profilowanie masy OLIgo (OLIMP) zewnątrzkomórkowych polisacharydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj metodę OLIMP do analizy polisacharydów ścian komórkowych roślin przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta umożliwia szybkie i czułe profilowanie struktur glikowych z minimalną ilością materiału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu OO0G01 Energy Biosciences Institute.

Metoda OLIMP została zaprezentowana na przykładzie głównej hemicelulozy występującej w ścianach komórkowych roślin dwudzielnych, ksyloglukanu, z wykorzystaniem endoglukanazy jako glikozylohydrolazy. Metodę zademonstrowano z użyciem całych siewek Arabidopsis jako źródła tkanki roślinnej. W zależności od pożąganej analizy, przy zastosowaniu tej samej procedury, enzym oraz materiał macierzy zewnątrzkomórkowej można zastąpić innymi. 1. Izolacja ściany komórkowej <ol> <li>Zabierz pięć 5-dniowych całych siewek Arabidopsis lub równoważną ilość pożądanego materiału i przenieś je do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5mL. Upewnij się, że materiał znajduje się na dnie probówki.</li> <li>Dodaj do probówki reakcyjnej dwie metalowe kulki o średnicy 3mm na wierzch próbki i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie.</li> <li>Rozetrzyj zamrożoną próbkę w młynku kulowym (2:30min, 25Hz).</li> <li>Dodaj do próbki 1mL 70% wodnego etanolu. Usuń metalowe kulki za pomocą magnesu. Dokładnie wymieszaj w wibratorze (vortex).</li> <li>Odwiruj próbkę przy 14 0rpm przez 10min, aby otrzymać osad z pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu zawierających materiał ścian komórkowych.</li> <li>Ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że nie naruszono osadu. </li> <li>Dodaj 1mL roztworu chloroformu/metanolu (1:1 v/v). Dokładnie wymieszaj wibratorze (vortex), aby resuspenderować osad.</li> <li>Odwiruj próbkę przy 14 0rpm przez 10min i ostrożnie usuń nadsącz poprzez aspirację. Upewnij się, że nie naruszono osadu.</li> <li>Osusz próbkę za pomocą koncentratora.</li> </ol> 2. Solubilizacja oligosacharydów <ol> <li>W celu solubilizacji konkretnego polisacharydu w postaci jego oligosacharydów, zawiesić suchy osad w 25μl odpowiedniego buforu. W przypadku endoglukanazy stosuje się 50mM mrzeczanu amonu, pH4.5. Dodać 0,2U endoglukanazy. Zawiesinę wymieszać wortexie, a następnie odwirować ciecz.</li> <li>Próbkę inkubować przez 16h w temperaturze 37°C w inkubatorze, przy wstrząsaniu z prędkością 30rpm.</li> <li>Usunąć rozpuszczalnik z hydrolizatu (wodę) za pomocą koncentratora.</li> </ol> 3. Analiza MALDI-TOF uwolnionych oligosacharydów <ol> <li>Kulki żywicy kationowymiennej BioRex MSZ 501 są używane do usuwania soli i enzymów z trawionej próbki. Przygotuj kulki, umieszczając porcję w pustej kolumnie i płucząc je obfite ilością wody.</li> <li>Dodaj 5-10 kulek BioRex do trawionej i wysuszonej próbki. Następnie dodaj 10μl wody; w przypadku mniejszych ilości materiału można użyć 5μl wody. Zanurz kulki w roztworze, krótko wirując probówkę. Inkubuj przez co najmniej 10min w temperaturze pokojowej.</li> <li>Nanieś 2μl matrycy (kwas 2,5-dihydroksybenzoowy (DHB), 10mg/ml w wodzie) na płytkę docelową MALDI. Odparuj rozpuszczalnik matrycy w próżni, aby uzyskać jednorodne kryształy chemiczne matrycy.</li> <li>Nanieś 2μl odsolonego roztworu próbki na kryształy matrycy na płytce docelowej. W przypadku nanoszenia dużej liczby próbek, proces ten nie powinien trwać dłużej niż 3min. Taki przedział czasowy gwarantuje, że pierwsza naniesiona próbka nie wyschnie jeszcze całkowicie. Odczekaj dodatkowe 2min, aby zapewnić dokładne wymieszanie rozpuszczonej matrycy i cząsteczek oligosacharydów próbki w ostatnio naniesionej próbce. Następnie wysusz płytkę docelową w próżni. Mieszanina próbka/matryca powinna skrystalizować się w czasie krótszym niż 1min, aby umożliwić jednorodną krystalizację.</li> <li>Umieść płytkę docelową w spektrometrze mas MALDI-TOF. Urządzenie powinno być ustawione w trybie dodatniego reflektronu z napięciem przyspieszającym 200V i opóźnieniem 350 nm; wybrany zakres mas powinien wynosić 50-30 Da (może ulec zmianie w zależności od oczekiwanych oligomerów). Rozpocznij naświetlanie laserem i zbierz 10-20 widm na próbkę, które zostaną zestawione w celu wygenerowania reprezentacyjnego widma średniego (Rysunek 2A). Jony reprezentujące konkretne oligosacharydy można zidentyfikować na podstawie ich stosunku masy do ładunku (m/z). Intensywności jonów (wysokość piku) wszystkich interesujących jonów powinny zostać zsumowane do 100%, co pozwoli określić względną zawartość każdego oligosacharydu w próbce (Rysunek 2B).</li> </ol> 4. Analiza in situ OLIMP Metoda OLIMP może być stosowana również bezpośrednio na tkance, z pominięciem wszelkich etapów przygotowania ścian komórkowych. Jako przykład wykorzystano etiolizowane podkiełszacze Arabidopsis jako źródło tkanki roślinnej. Ponownie zastosowano endoglukanazę w celu określenia struktury hemiceluloz ksyloglukanowych. W zależności od pożągowanej analizy, przy zastosowaniu tej samej procedury, można zmienić enzym oraz materiał tkankowy. <ol> <li>Zebrać etiolizowaną siewkę, umieścić ją na pustej płytce docelowej MALDI i pozostawić do wyschnięcia.</li> <li>Nanieść 0,5μl endoglukanazy (0,4U/μl, rozpuszczonej w 50mM formianie amonu, pH4,5) na wysuszoną siewkę w wybranym miejscu. Należy upewnić się, że kropla enzymu częściowo dotyka płytki docelowej. </li> <li>Umieścić płytkę docelową MALDI w zamkniętym pojemniku z nasyconą wilgotnością, aby zapobiec wysychaniu kropli enzymu. Inkubować płytkę w komorze przez 16h w temperaturze 37°C.</li> <li>Wysuszyć płytkę docelową MALDI z tkanką roślinną i kroplą enzymu w próżni.</li> <li>Nanieść 0,5μl matrycy (DHB; 10mg/l) na każdą wysuszoną plamkę enzymu. Pozostawić na 2min.</li> <li>Wysuszyć płytkę docelową MALDI w próżni.</li> <li>Przeanalizować próbki za pomocą MALDI-TOF. Umieścić płytkę docelową z tkanką i plamką(mi) enzymu/matrycy w spektrometrze mas MALDI-TOF. Urządzenie powinno być ustawione w dodatnim trybie reflektronowym z napięciem przyspieszającym 20V i opóźnieniem 350 nm; wybrany zakres mas powinien wynosić 50-30 Da (może ulec zmianie w zależności od oczekiwanych oligomerów).</li> <li>Zacząć naświetlać laserem kryształy matrycy/próbki OBOK tkanki. Należy upewnić się, że laser nie trafia w samą tkankę, ponieważ w takim przypadku czas przelotu cząsteczek będzie błędny. Zebrać około 20-50 widm z plamki, które zostaną zestawione w celu wygenerowania reprezentatywnego widma średniego (Rysunek 3). Jony reprezentujące konkretne oligosacharydy można zidentyfikować po ich stosunku masy do ładunku (m/z). Można podać intensywności jonów (wysokość piku), a wszystkie interesujące jony powinny zostać zsumowane do 100%, co pozwoli określić względną zawartość każdego oligosacharydu w próbce.</li> </ol> 5. Reprezentatywne wyniki Przykład analizy OLIMP hemiceluloz ksyloglukanowych występujących w siewkach Arabidopsis przedstawiono na rysunku 2. Dzięki różnicom w masach jonów oraz dobrze zcharakteryzowanej specyficzności enzymu (endoglukanazy), jony można przypisać do konkretnych struktur oligosacharydów (rysunek 2A). Oczywiście nie można odróżnić izomerów strukturalnych. Podstawowym założeniem dla oznaczenia względnej zawartości poszczególnych oligosacharydów (rysunek 2B) jest fakt, że ich współczynnik odpowiedzi w spektrometrii mas jest bardzo podobny dla tych oligosacharydów. Jak pokazano tutaj, ilościowe oznaczenie metodą OLIMP jest wysoce powtarzalne. Należy jednak pamiętać, że odporność metody jest w dużym stopniu zależna od stosunku sygnału do szumu dla poszczególnych jonów oligosacharydów. Na przykład zanieczyszczenie solami lub mniejsze ilości oligosacharydów mogą zmniejszyć ten stosunek. Analiza OLIMP przeprowadzona bezpośrednio na tkance (analiza in situ) umożliwia badanie bardzo małych i precyzyjnie określonych obszarów oraz wymaga minimalnego przygotowania próbek. W przedstawionym tutaj przykładzie (Rysunek 3) nie zaobserwowano różnic jakościowych (te same jony), lecz ilościowe (zróżnicowanie intensywności jonów) pomiędzy tkanką pędu i korzenia siewki Arabidopsis. Zatem modyfikacje metody OLIMP mogłyby prowadzić do uzyskania „obrazowania” tkanek. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="Analiza ściany komórkowej roślin; trawienie enzymatyczne; spektrometria mas MALDI-TOF; schemat procesu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Schemat procedury OLIMP z wykorzystaniem całości Arabidopsis siewki jako źródło roślinne. Najpierw tkankę maceruje się i przygotowuje materiał ze ścian komórkowych (rysunek zmodyfikowany na podstawie Fujino et al.10Następnie, przy użyciu specyficznej hydrolazy, uwalniane są oligosacharydy konkretnego polisacharydu ścian komórkowych. Na koniec, za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF, wyznaczana jest względna zawartość rozpuszczalnych oligosacharydów. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="Analiza spektrometryczna; oligosacharydy ksyloglukanu; wykres m/z względem intensywności; wykres słupkowy względnej liczebności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Względna zawartość oligosacharydów ksyloglukanu w etiolizowanych siewkach z Arabidopsis wyznaczone za pomocą OLIMP. A) Reprezentatywne widmo masy oligosacharydów ksyloglukanu; każdy jon reprezentuje konkretną strukturę oligosacharydu, izomerów strukturalnych nie można rozróżnić. B) Odpowiadający temu wykres słupkowy służący do oznaczenia względnej zawartości oligosacharydów. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="Analiza włosa z zaznaczeniem punktów pobierania próbek i widmami chromatograficznymi; dochodzenie kryminalistyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. In situ Analiza OLIMP z wykorzystaniem etiolizowanych siewek Arabidopsis jako przykład. Każda kropla z enzymem/trawieniem (kolorowe okręgi) może być analizowana niezależnie, a odpowiadające jej widma mas mogą zostać uzyskane i przeanalizowane. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="Wykres spektrometrii masowej; analiza pentoz, piki kwasu glukuronowego, % intensywności w funkcji stosunku m/z." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rysunek 4. Widmo OLIMP hemicelulozowego ksylanu otrzymanego w wyniku trawienia materiału z liści Miscanthusu ksylanazą (Megazyme).

<ol><li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li>
<li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li>
<li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xyloglucan-specific+endo-beta-1%2C4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus%3A+expression+cloning+in+yeast%2C+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li>
<li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa%3A+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li>
<li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation%3A+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+%22%5BJournal%5D)">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1%2C2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li>
<li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li>
<li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li>
<li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils%2C+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li>
<li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li>
<li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan%2C+a+major+primary+cell+wall+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li>
<li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+liquid+chromatography%2C+capillary+electrophoresis%2C+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li>
<li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda OLIMP umożliwia bardzo czułą i szybką analizę polimerów obecnych w macierzach zewnątrzkomórkowych. OLIMP łączy enzymatyczne uwalnianie oligomerów z późniejszą analizą MALDI-TOF. Generowanie widma MALDI-TOF trwa mniej niż minutę, dzięki czemu OLIMP nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań, w tym do badań wysokoprzepustowych, takich jak skryning mutantów. OLIMP nie ogranicza się do polisacharydów roślinnych i potencjalnie może być stosowany do szerokiej gamy polimerów, będąc ograniczonym jedynie dostępnością specyficznych enzymów hydrolitycznych. Ograniczeniem metody OLIMP jest jednak fakt, że nie można za jej pomocą uzyskać bezwzględnej ilości polimeru. Jak wspomniano wcześniej, metoda OLIMP może być wykorzystywana do badania struktury różnorodnych polisacharydów obecnych w macierzy zewnątrzkomórkowej wielu gatunków. Przykładowo, rycina 4 przedstawia widmo OLIMP głównego hemicelulozy występującej u traw – ksylanu. W tym przypadku materiał ścian komórkowych pochodzący z umiarkowanego gatunku traw Miscanthus został poddany trawieniu ksylanazą.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2,5-dihydroksybenzoowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37550</td><td>10mg/mL w wodzie</td></tr><tr><td>Żywica BioRex MSZ 501(D)</td><td>Bio-Rad</td><td>142-7425</td><td></td></tr><tr><td>Endoglukanaza</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td></td></tr><tr><td>Ksylanaza M6</td><td>Megazyme</td><td>E-XYRU6</td><td></td></tr><tr><td>Metalowe kulki 3mm</td><td>Retsch</td><td>22.455.0011</td><td></td></tr><tr><td>Młynek kulowy</td><td>Retsch</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>Axima Performance</td><td></td></tr><tr><td>Płyta docelowa MALDI</td><td>Kratos Analytical</td><td>DE4555TA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Eppendorf</td><td>Vacufuge 5301</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Welch Allyn</td><td>DryFast Ultra 2032</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie masy oligosacharydów (olimp) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

Bezpośredni kontakt komórek z otoczeniem jest u wielu organizmów pośredniczony przez macierz zewnątrzkomórkową. Wspólną cechą macierzy zewnątrzkomórkowych jest obecność złożonych reszt cukrowych w postaci glikoprotein, proteoglikanów i/lub polisacharydów. Przykłady obejmują macierz zewnątrzkomórkową ludzi i komórek zwierzęcych, składającą się głównie z białek włóknistych i proteoglikanów, polisacharydowe ściany komórkowe roślin i grzybów oraz ściany komórkowe bakterii oparte na proteoglikanach i glikolipidach. Wszystkie te glikostruktury odgrywają kluczową rolę w komunikacji i sygnalizacji międzykomórkowej oraz między komórką a środowiskiem.
Niezwykle złożonym przykładem macierzy zewnątrzkomórkowej są ściany komórek roślin wyższych. Składają się one niemal w całości z cukrów, które stanowią do 75% masy suchej, i obejmują najliczniejsze biopolimery występujące na naszej planecie. W związku z tym prowadzone są badania nad tym, jak najlepiej wykorzystać te materiały jako neutralne pod względem emisji węgla odnawialne zasoby w celu zastąpienia petrochemikaliów pochodnych z paliw kopalnych. Głównym wyzwaniem w procesie konwersji do paliw pozostaje oporność ścian na degradację enzymatyczną lub chemiczną, wynikająca z unikalnych glikostruktur obecnych w tym wyjątkowym biokompozycie.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę szybkiej i czułej analizy glikostruktur ścian komórkowych roślin. Metoda ta, nazwana OLIgo Mass Profiling (OLIMP), opiera się na enzymatycznym uwalnianiu oligosacharydów z materiałów ściennych z wykorzystaniem specyficznych glikozylohydrolaz oraz późniejszej analizie rozpuszczonych mieszanin oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą i analizą czasu przelotu (MALDI-TOF/MS)1 (Rysunek 1). OLIMP wymaga ścian zaledwie 5000 komórek do przeprowadzenia pełnej analizy, może być wykonywany bezpośrednio na tkance2 i nadaje się do analiz wysokoprzepustowych3. Chociaż za pomocą metody OLIMP nie można określić bezwzględnej ilości rozpuszczonych oligosacharydów, to na podstawie widm mas można określić względną obfitość różnych jonów oligosacharydów, co pozwala uzyskać informacje o wzorcu podstawienia natywnych polisacharydów obecnych w ścianie.
Metodę OLIMP można wykorzystać do analizy szerokiej gamy polimerów ścian komórkowych, ograniczonej jedynie dostępnością odpowiednich enzymów4. Przykładowo, do analizy polimerów obecnych w ścianie komórkowej roślin dostępne są enzymy pozwalające na analizę hemiceluloz: ksyloglukanu przy użyciu ksyloglukanazy5, 11, 12, 13, ksylanu przy użyciu endo-β-(1-4)-ksylanazy 6,7 lub polisacharydów pektynowych przy użyciu kombinacji poligalaktronazy i metyloesterazy 8. Co więcej, stosując te same zasady OLIMP, można monitorować i określać aktywności glikozylohydrolaz, a nawet glikozyltransferaz 9.

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Bezpośredni kontakt komórek z otoczeniem jest w wielu organizmach pośredniczony przez macierz zewnątrzkomórkową. Wspólną cechą macierzy zewnątrzkomórkowych jest...

Przedstawione tutaj profilowanie masy oligomerów, czyli eksperyment Olympic, pozwala na szybkie uzyskanie informacji o strukturze polimerów w macierzy zewnątrzkomórkowej lub ścianie komórkowej organizmu. W tym przypadku ściany komórkowe przygotowuje się z siewek roślin, najpierw usuwając składniki komórkowe za pomocą 70% ethanol. Następnie docelowy polimer ścian komórkowych poddaje się trawieniu specyficzną hydrolazą, która solubilizuje określone składniki ścian w formie oligomerów.Alternatywnym podejściem jest trawienie ściany komórkowej enzymem z sekcji C dwa bezpośrednio w tkance. Względna zawartość uwolnionych ligandów jest określana za pomocą spektrometrii mas MALDI oraz analizy statystycznej. Cześć, jestem Marcus Polly z Energy Biosciences Institute na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley.Witam, jestem Marcus Re. A ja jestem Asha Giller. My również pochodzimy z Energy Biosciences Institute. Organizmy są otoczone macierzami pozakomórkowymi, które w zależności od organizmu składają się ze złożonych sieci polimerowych.Szybkim i czułym sposobem oceny macierzy pozakomórkowej jest metoda, którą nazywamy profilowaniem masy oli (w skrócie oleum), którą zaprezentujemy dzisiaj. Procedurę tę można przeprowadzić również bezpośrednio na tkance roślinnej. Zacznijmy zatem.Procedurę tę należy rozpocząć od wyizolowania macierzy zewnątrzkomórkowej lub ściany komórkowej tkanek roślinnych. Zbierz pięć siewek arabidopsis lub równoważną ilość innego materiału roślinnego i przenieś je do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że materiał znajduje się na dnie probówki.Do probówki reakcyjnej dodaj dwie metalowe kulki o średnicy 3 mm i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie. Następnie zmiel zamrożoną próbkę w młynku kulowym przez 2,5 minuty przy częstotliwości 25 Hz. Po zmieleniu materiału dodaj do próbki 1 mL 70% wodnego etanolu.Usuń metalowe kulki za pomocą magnesu i dokładnie wymieszaj na wstrząsarze typu vortex. Zabieg ten solubilizuje większość białek i organelli komórkowych; odwiruj próbkę z prędkością 14,000 RPM przez 10 minut, aby otrzymać osad z pozostałości nierozpuszczalnych w alkoholu, reprezentujących materiał ściany komórkowej. Ostrożnie odessij nadsącz, dbając o to, aby nie naruszyć osadu.Do osadu pozostałego w probówce dodać 1 mL roztworu chloroformu i metanolu, a następnie dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. W celu resuspensji osadu odwirurować próbkę; ekstrakcja chloroformowo-metanolowa usuwa związki hydrofobowe, takie jak lipidy. Po wirowaniu usunąć nadsącz i całkowicie osuszyć osad w wirówce próżniowej. Tym samym kończy się izolacja materiału ściany komórkowej, który może być teraz poddany dalszej obróbce w celu uzyskania specyficznych ligandów.Przykład zaprezentowany w tym materiale dotyczy solubilizacji ksyloglukanu, głównej hemicelulozy występującej w ścianach komórkowych roślin dwuliściennych, takich jak Arabidopsis. Ksyloglukan jest polimerem składającym się z szkieletu glukanowego, który jest silnie podstawiony innymi resztami cukrowymi. Do solubilizacji tego polimeru wykorzystuje się grzybową endoglukanazę w celu rozpuszczenia tej hemicelulozy. Zawiesić ponownie suchy, wyizolowany osad ściany komórkowej w 25 µL 50 mM mrzeczanu amonu o pH 4,5 i dodać 0,2 jednostek endoglukanazy. Wymieszać zawiesinę w wstrząsarze wortex i odwirować ciecz.Umieść probówkę w mieszalniku i inkubuj w celu trawienia ścian przez 16 godzin w temperaturze 37 °C przy potrząsaniu. Przy 300 RPM. Po zakończeniu trawienia wyizolowanej ściany komórkowej usuń rozpuszczalnik za pomocą wirówki próżniowej, a następnie przystąp do analizy uwolnionych oligosacharydów metodą spektrometrii mas; sole i enzymy usuwa się z trawionej próbki, wykorzystując kuleczki żywicy wymiany kationowej Biox MSD 5 0 1.Kuleczki należy najpierw przygotować, umieszczając wymaganą ilość w pustej kolumnie i przepłukując je obfitymi ilościami wody. Do strawionego i wysuszonego materiału dodać od 5 do 10 przygotowanych kuleczek kationowych biox. Następnie, w przypadku mniejszych ilości materiału, dodać 10 µl wody.Można użyć pięciu mikrolitrów wody. Zanurzyć kuleczki w roztworze, krótko wirując probówkę, a następnie inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy trawienie zachodzi w obecności kuleczek. Nanieść dwa mikrolitry matrycy DHB na płytkę docelową MALDI.Odparuj rozpuszczalnik matrycy pod próżnią, aż do powstania kryształów chemicznych matrycy, a następnie nanieś 2 µL roztworu odsolonego trawienia na kryształy matrycy na płytce docelowej. Rozpuszczalnik z naniesionej plamki matrycy próbki ponownie odparuj pod próżnią.Ważne jest zachowanie odpowiedniego czasu mieszania ciekłej matrycy próbki przed krystalizacją, zgodnie ze szczegółowym opisem w dołączonym protokole pisemnym. Po wyschnięciu próbki umieść płytkę docelową w spektrometrze mas MALDI. Ustaw urządzenie w trybie pozytywnym z napięciem przyspieszającym 20 000 V i opóźnieniem 350 nm.Wybrany zakres mas dla tych wiązań hemicelulozowych wynosi od 500 do 3000 Daltons. Zakres mas należy zmodyfikować zgodnie z wielkością oczekiwanych wiązań. Należy rozpocząć impulsowanie laserem i zebrać od 100 do 200 widm na próbkę, które zostaną zestawione w celu wygenerowania reprezentatywnego widma średniego.Jest to widmo hemicelulozy uzyskane metodą oly. Metoda oly zaprezentowana w tym filmie może być stosowana bezpośrednio na tkance roślinnej, z pominięciem etapów przygotowania ścian komórkowych. Ta procedura analizy in situ została zademonstrowana na siewkach arabidopsis hodowanych w ciemności.Preparat umieszcza się bezpośrednio na płytce docelowej i suszy na powietrzu do całkowitego wyschnięcia siewki na płytce. Należy dodać 0,5 µL odpowiedniej mieszaniny buforu enzymatycznego w wybranych pozycjach. Należy upewnić się, że kropla enzymu częściowo styka się z tkanką i z płytką docelową.Umieść płytkę docelową MALDI w zamkniętym pojemniku z nasyconą wilgotnością, aby zapobiec wysychaniu kropel enzymu. Inkubuj płytkę przez 16 godzin w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu okresu inkubacji wysusz plamki enzymu w próżni, a następnie nanieś 0,5 µl ciekłej matrycy DHB na każdą z wysuszonych plamek enzymu.Następnie wysusz płytkę docelową MALDI w próżni. Aby przeanalizować NC, przygotuj dwie próbki. Umieść płytkę docelową, zawierającą plamki enzymatycznej matrycy z preparatem tkankowym, w spektrometrze mas i zarejestruj widma mas, stosując te same ustawienia, co w przypadku próbki izolowanej ściany komórkowej.Rozpocznij naświetlanie matrycy laserem. Pobierz próbki kryształów znajdujących się obok tkanki. Upewnij się, że laser nie trafia w samą tkankę, ponieważ w takim przypadku czas przelotu cząsteczek będzie błędny.Zbierz od 20 do 50 widm na punkt i zestaw je, aby wygenerować reprezentatywne widmo średnie. Jest to reprezentatywne widmo średnie oligosacharydów pochodzących z glukanu HemosIL obecnego w AOPs. Suma intensywności jonów lub wysokości wszystkich analizowanych jonów jest sprowadzona do 100%, co daje względną obfitość poszczególnych oligosacharydów.Wynik metody NC two OMP daje podobne rezultaty. Każda kropla z trawieniem enzymatycznym, zaznaczona kolorowym okręgiem, może być analizowana niezależnie, a odpowiadające jej widma mas mogą być pozyskane i przeanalizowane. Metodę tę można również przeprowadzić na innych polimerach macierzy zewnątrzkomórkowej, pod warunkiem dostępności odpowiedniego enzymu hydrolizującego.Jako przykład przedstawiono widmo oola hemocelulozy cyliny obecnej w roślinie energetycznej. Ms.Canus uzyskał zaprezentowane dane, podczas gdy materiał z liścia mecampus został poddany trawieniu za pomocą xin. W celu przypisania struktur do jonów należy zapoznać się z towarzyszącym protokołem.Właśnie zaprezentowaliśmy procedurę profilowania masy oligomerów w komórkach exo cellular metrics. Polimery. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że najlepsze wyniki można uzyskać, gdy dla analizy OV MS uzyskano jednorodne wyniki macierzy. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

oligo-mass-profiling-olimp-of-extracellular-polysaccharides

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza masy oligomerów (OLIMP) polisacharydów pozakomórkowych

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Źródło: Hu, Y. i inni. Analiza interakcji między endobiotyką a ludzką mikrobiotą jelitową z wykorzystaniem systemów fermentacji w kąpielach in vitro. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) do oceny degradacji egzopolisacharydów (EPS) przez ludzką mikrobiotę kałową. Fragmenty EPS w supernatantach fermentacyjnych są rozdzielane na podstawie rozmiaru i polaryzacji za pomocą TLC, a następnie wizualizowane jako kolorowe pasy po barwieniu...

Wykonywanie chromatografii cienkowarstwowej w celu oceny degradacji egzopolisacharydów bakterii

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Tutaj opisane są protokoły izolacji cyjanobakteryjnych polimerów węglowodanowych uwalnianych i izolacji ich egzoproteomów. Obie procedury obejmują kluczowe etapy uzyskiwania polimerów lub białek o wysokim stopniu czystości, które można wykorzystać do dalszej analizy lub zastosowań. Można je również łatwo dostosować do konkretnych potrzeb użytkownika.

Patrząc na zewnątrz: izolacja polimerów i białek węglowodanowych uwalnianych przez sinice

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Poznaj metodę OLIMP do analizy polisacharydów ścian komórkowych roślin przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta umożliwia szybkie i czułe profilowanie struktur glikowych z minimalną ilością materiału.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów