Name: Mikroiniekcja pod kontrolą ultradźwięków do przodomózgowia myszy w macicy przy E9,5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj mikroiniekcję wektorów retrowirusowych do przodomózgowia myszy pod kontrolą ultradźwięków w macicy przy E9,5. Ta metoda umożliwia precyzyjną manipulację ekspresją genów w komórkach macierzystych podczas rozwoju mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Część 1. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
<li>W przypadku pracy z odczynnikami biologicznymi (np. wektorami retrowirusowymi), zabieg powinien być przeprowadzony w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (BSC). Mikroskop ultradźwiękowy z analizą rozproszenia wstecznego (UBM) powinien znajdować się obok komory BSC, przy czym przetwornik musi być umieszczony wewnątrz komory i stabilizowany przez sterowany silnikiem uchwyt na specjalnie zaprojektowanym stole chirurgicznym. Elementy niezbędne do konstrukcji stołu pokazanego w filmie są wymienione w dostępnej w sieci liście. Lista ta, wraz z obrazami stołu pod różnymi kątami (dostępnymi na żądanie), powinna umożliwić jego budowę.</li>
<li>Otwieranie i zamykanie laparotomii (procedury chirurgicznej, w której jama brzuszna zostaje nacięta w celu uzyskania dostępu do narządów wewnętrznych) wykonuje się zazwyczaj na podkładzie chłonnym z plastikowym spodem. Przed zabiegiem wszystkie niezbędne narzędzia (np. żyletka, nożyczki chirurgiczne, pęseta, załadowany aplikator klipsów autoklipowych itp.) oraz materiały (np. PBS, szwy, środek znieczulający, uchwyt dla myszy i nakładająca go płyta itp.) powinny zostać wysterylizowane i umieszczone w strefie chirurgicznej. Ograniczenie czasu pozostawania nacięcia otwartego jest istotne dla zmaksymalizowania szans powodzenia zabiegu. Wszystkie czynności związane z obsługą zwierząt należy wykonywać w rękawiczkach zdezynfekowanych roztworem MB-10 lub jego odpowiednikiem. Dezynfekcję należy powtarzać w razie potrzeby, aby zapewnić sterylność rękawiczek.</li>
</ol>
Część 2. Znieczulenie myszy
<ol>
<li>Napełnić strzykawkę 1 cc roztworem znieczulającym zawierającym 1 część Nembutalu (50 mg/ml pentobarbitalu) na 4 części przefiltrowanego, wysterylizowanego siarczanu magnezu 25 mg/ml w PBS. W rezultacie powstanie roztwór zawierający 10 mg/ml pentobarbitalu i 20 mg/ml siarczanu magnezu. Każdą mysz należy zważyć indywidualnie i wstrzyknąć 90 mg pentobarbitalu na kg masy ciała (np. myszy o masie 28 gm należy wstrzyknąć 250 μL).</li>
<li>Wstrzyknąć do jamy brzusznej (dootrzewnowo, IP) ciężarnej myszy w dniu embrionalnym (E) 9,5 (można stosować inne stadia wiekowe w zależności od potrzeb), przebijając skórę i mięśnie brzucha. Odczekać 8-12 minut, aż mysz przestanie reagować. Odpowiednie znieczulenie należy potwierdzić poprzez rozluźnienie postawy zwierzęcia oraz brak ruchu w odpowiedzi na uciskanie ogona i palców u stóp. Delikatne uciskanie między paznokciami jest bardzo czułe, a brak jakiejkolwiek reakcji na taki bodziec wskazuje, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone. Należy zauważyć, że nawet zwierzęta całkowicie nie reagujące na uciskanie ogona i palców mogą czasami lekko drgnąć w odpowiedzi na początkowe nacięcie chirurgiczne. Jest to jednak reakcja odruchowa i nie świadczy o niewystarczającym znieczuleniu. Na oczy myszy należy nałożyć maść okulistyczną na bazie wazeliny, aby zapobiec ich wysychaniu podczas operacji.</li>
<li>Przygotować obszar operacyjny i aparat USG w czasie oczekiwania na znieczulenie myszy. Ponieważ użycie retrowirusów lub lentiwirusów wymaga warunków bezpieczeństwa BSL2, zgodnie z powyższym iniekcje wirusowe powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Ponadto wszystkie roztwory i materiały jednorazowe, które miały kontakt z wirusem, należy zdekontaminować 10% roztworem wybielacza. Narzędzia chirurgiczne i sprzęt USG należy przemyć roztworem sterylizującym, takim jak MB-10 (<a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a>) lub odpowiednikiem stosowanym w danej placówce.</li>
</ol>
Część 3. Ekspozycja embrionów
<ol>
<li>Jeśli to możliwe (w zależności od ograniczeń danej świetlicy dla zwierząt i dostępnej przestrzeni), zaleca się, aby obszar przygotowania chirurgicznego znajdował się w innym miejscu niż obszar operacyjny. Zminimalizuje to ryzyko kontaminacji krzyżowej między zwierzętami. Aby rozpocząć operację, połóż zwierzę na plecach na sterylnej powierzchni chłonnej i dokładnie przemyj obszar brzucha 70% etanolem. Można zastosować bardziej rozbudowane zabiegi przedoperacyjne (np. kolejne rundy przemywania Betadyną i 70% etanolem), jednak w naszym doświadczeniu nie jest to konieczne w przypadku tego typu operacji przeżyciowych u gryzoni. Używając brzytwy dwustronnej, usuń sierść z brzucha na obszarze o szerokości około 1 cala i długości 1,5 cala. Wykonuj krótkie, szybkie ruchy brzytwą pod kątem około 45°. Ważne jest, aby obszar operacyjny został odpowiednio przygotowany, ale nie został nadmiernie zwilżony, ponieważ może to doprowadzić do niepotrzebnego wychłodzenia zwierzęcia, a nawet do hipotermii.</li>
<li>Używając cienkich nożyczek chirurgicznych, wykonaj najpierw 1-calowe cięcie podłużne przez skórę, a następnie przez mięśnie brzucha zwierzęcia (przecięcie tkanki łącznej wiążącej skórę z mięśniami ułatwi wykonanie drugiego cięcia). Należy pamiętać, że przez cały czas trwania procedury należy dbać o to, aby narzędzia chirurgiczne pozostały sterylne, a w razie potrzeby (np. gdy końcówki narzędzi zetkną się z materiałem niesterylnym) należy przeprowadzić dezynfekcję.</li>
<li>Używając pęsety, ostrożnie wyciągnij rogi macicy i zanotuj liczbę embrionów po każdej stronie. Pozostawiając odsłonięte dwa sąsiednie embriony (wybór dwóch zależy od konfiguracji po każdej stronie), umieść większość rogów macicy z powrotem wewnątrz zwierzęcia. W tej konfiguracji dwa embriony będą odsłonięte w danym czasie i kąpane w PBS, podczas gdy matka pozostanie w pozycji na plecach.</li>
<li>Umieść zwierzę na plecach w uchwycie z pleksiglasu, w którym będzie znajdować się podczas operacji (Rycina 1A)*. Następnie opuść 10 cm szalkę do hodowli tkanek** (którą przed użyciem należy zdezynfekować preparatem MB-10) nad matką, używając pęsety umieszczonej lekko przez zieloną membranę silastykową (wykonaną z bazy gumy silikonowej L RTV i utwardzacza; numery produktów Dow-Corning odpowiednio 3142761 i 2156946). Obniżając szalkę nad zwierzęciem, użyj pęsety, aby chwycić tkankę macicy między dwoma embrionami przeznaczonymi do iniekcji i delikatnie przeciągnij je przez membranę. Jednocześnie szalka zostaje całkowicie opuszczona na uchwyt, a pinezki zostają wciśnięte, aby utrzymać ją na miejscu. Do szalki dodaje się następnie uprzednio ogrzany (do 37°C) PBS, aby całkowicie przykryć embriony.</li>
<li>Umieść stopień iniekcyjny ze zwierzęciem i odsłoniętymi embrionami pod sondą ultrasonograficzną (Rycina 1A), aby uzyskać obrazowanie w czasie rzeczywistym odsłoniętych embrionów przez ścianę macicy (Rycina 1B). Następnie sonda zostaje opuszczona (za pomocą sterowania zmotoryzowanego) do kąpieli w PBS bezpośrednio nad embrionami, które mają zostać zobrazowane. Obrazy można uzyskać, gdy sonda znajduje się w odległości około 2-3 mm od embrionów. Bardzo ważne jest upewnienie się, że głowica sondy nie uderza w embriony podczas oscylacji w przód i w tył w celu gromadzenia obrazów.</li>
</ol>
* Uchwyt, w którym samica spoczywa podczas operacji, można łatwo wykonać w warsztacie mechanicznym. Powinien on składać się z szerokiej podstawy z pleksiglasu z dwiema przyklejonymi na górze ściankami z pleksiglasu oraz wolną przestrzenią między nimi (wystarczająco szeroką, aby zmieściła się w niej mysz leżąca na grzbiecie). W ściankach powinno zostać wyżłobione wgłębienie, które następnie wypełnia się czarnym woskiem (np. z kuwety sekcyjnej). Wosk ten służy jako materiał, w którym wbija się pinezki, aby przymocować płytkę z PBS, w której kąpią się embriony podczas iniekcji.

W szalkach bakteriologicznych o średnicy 10 cm należy wyciąć w centrum dna otwór (o średnicy ok. 2 cm); można to wykonać za pomocą przenośnego dziurkacza Heavy Duty Portable Punch z końcówką 13/16th okrągła matryca calowa: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm</a>). Ponadto, po obu stronach otworu centralnego (w odległości około 1,5 cm) należy wypalić dwa małe otwory za pomocą rozgrzanej w płomieniu igły (lub można je wykonać wiertłem). Otwory te należy następnie pokryć smarem próżniowym; będą one służyć jako miejsca, w których pinezki mocujące płytkę do uchwytu zostaną wbite w czarny wosk. Smar próżniowy ma zapobiegać wyciekowi buforu PBS.

Część 4. Napełnianie igły do mikroiniekcji wirusem
<ol>
<li>Przygotuj igłę do mikroiniekcji poprzez ścięcie pod kątem szklanej kapilary wyciąganej o średnicy wewnętrznej 1mm. Ostrość igły jest krytyczna; praca z niewystarczająco ostrą igłą może poważnie utrudnić penetrację ściany macicy i pęcherza owodniowego, co może prowadzić do niepowodzenia eksperymentu. Następnie zaostrzoną igłę umieszcza się w uchwycie do pipety, który jest połączony za pomocą rurek z mikroszystryką o pojemności 25 μL zamontowaną w ręcznej pompie infuzyjno-aspiracyjnej (do regulacji napełniania i opróżniania igły można użyć innych urządzeń, ale to rozwiązanie jest pokazane na filmie). Aby uzyskać optymalną responsywność (i uniknąć rozszerzania oraz sprężania związanych z systemem wypełnionym powietrzem), mikroszystrykę, rurki i igłę należy wypełnić olejem mineralnym.</li>
<li>Przed napełnieniem igły należy upewnić się, że w systemie — od strzykawki aż po końcówkę igły — nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie, przed rozpoczęciem ładowania wirusa, wciągnij do igły mały pęcherzyk powietrza (o długości 1-2 mm). Ta kieszonka powietrzna pomaga utrzymać separację między wirusem a olejem mineralnym. Wstrzykiwany stok wirusa powinien zawierać polybrene w końcowym stężeniu 0,08 mg/ml (więcej informacji na temat produkcji wirusa znajduje się w referencjach 1, 2). Należy pamiętać, że stężone stok retrowirusowe zazwyczaj zawierają znaczną ilość materii cząsteczkowej, w której znajduje się większość materiału zakaźnego, dlatego nie można ich filtrować bez 5- do 10-krotnego spadku miana. Ponadto, w zależności od preparacji, stok wirusa może być lepki ze względu na genomiczne DNA z lizowanych komórek pakujących (szczególnie w przypadku użycia komórek 293 do generowania wirusa pseudotypowanego MLV/VSV). Jeśli alikwot wirusa jest lepki, można i należy dodać niewielką ilość DNAse I, aby rozrzedzić stok, w przeciwnym razie napełnienie igły będzie niezwykle trudne. Kroplę stoku wirusa (8-10 μL) należy umieścić na sterylnym kawałku parafilmu w przygotowaniu do napełnienia igły. Następnie, używając pompy aspiracyjnej, ostrożnie napełnij igłę, dbając o to, aby nie doprowadzić do zatkania. Umieść napełnioną igłę w pozycji mikromanipulatora w obszarze iniekcji, uważając, aby nie złamać igły na embrionach lub sondzie ultradźwiękowej. Należy zauważyć, że jeśli z jakiegoś powodu igła zostanie napełniona znacznie przed planowaną iniekcją, pomocne może być wciągnięcie niewielkiej ilości powietrza do końcówki, którą można wypuścić przed rozpoczęciem iniekcji. Ta kieszonka powietrzna może chronić przed wysychaniem stoku wirusa na końcówce igły (zdarzenie, które prawie zawsze sprawia, że napełniona igła staje się bezużyteczna).</li>
</ol>
Część 5. Iniekcja wirusowa pod kontrolą ultradźwięków
<ol>
<li>Obraz w czasie rzeczywistym generowany przez sondę ultradźwiękową jest wizualizowany na monitorze wideo i może służyć do prowadzenia igły do mikroiniekcji do zarodka. Przy użyciu tego systemu wirusa można wstrzyknąć do pęcherzyka owodniowego w dniu E8.5 lub do pęcherzyka owodniowego bądź układu komorowego w dniach od E9.5 do E11.5 (Rycina 1B). Jest to najtrudniejsza część procedury, która wymaga znacznego doświadczenia praktycznego, aby ją opanować (rzędu 5-20 godzin, w zależności od badacza). Końcówka igły jest widoczna na obrazie USG jako najjaśniejszy punkt na ekranie i powinna poruszać się zgodnie z korektami pozycji sondy (przy użyciu sterowania zmotoryzowanego w płaszczyznach y i z oraz sterowania ręcznego w płaszczyźnie x). Krytycznie ważne jest, aby kierunek oscylacji sondy był równoległy do długości igły. Zapewni to, że końcówka igły pozostanie w płaszczyźnie obrazowania podczas ruchów pozycjonujących ją do iniekcji do zarodka.</li>
<li>Zarodka należy ustawić tak, aby obszar docelowy (w tym przypadku komora przodomózgowia) był łatwo widoczny i dostępny dla igły przy najmniejszej ilości materiału macicy na drodze iniekcji. Ponadto krytyczne jest, aby nie wstrzykiwać przez łożysko. Gdy docelowy obszar mózgu zostanie wyrównany z kierunkiem posuwania igły (za pomocą pokrętła w mikromanipulatorze), igła powinna jedynie dotykać ściany macicy, a następnie krótkie, szybkie pchnięcie do przodu powinno przebić tkankę. Podobne podejście stosuje się w celu przebicia pęcherzyka owodniowego, a następnie mózgu. W niektórych przypadkach doświadczony badacz może trafić do komory jednym ruchem, szczególnie jeśli igła jest bardzo ostra. Mechanika poruszania sondą, igłą i zarodkami (poprzez przesuwanie matki na stole) wymaga praktyki, aby ją opanować.</li>
<li>Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby zarodków należy zamknąć ścianę brzuszną szwami z jedwabiu 5.0. Technika szycia nie jest specyficzna dla tego rodzaju operacji. Na koniec należy użyć weterynaryjnych klipsów do zszycia skóry nad szwami w mięśniach brzucha. Szycie skóry nie jest zalecane, ponieważ mysz może wygryźć szwy. W miejscu nacięcia należy zastosować leki przeciwbólowe, aby zmniejszyć ból odczuwany przez mysz podczas budzenia się. Zaleca się podskórne wstrzykiwanie 0,25% roztworu Bupiwakainy (0,8 ml/kg lub 2 mg/kg) co kilka milimetrów wzdłuż miejsca nacięcia.</li>
<li>Podczas rekonwalescencji myszy należy delikatnie położyć zwierzę na papierze chłonnym w czystej klatce zawierającej żelowy wkład chłodzący (aby ułatwić karmienie i nawadnianie). Klatkę należy umieścić na podgrzewaczu do szkiełek ustawionym na 37°C w celu utrzymania temperatury ciała. Po przebudzeniu mysz wraz z wkładem żelowym należy przenieść do czystej klatki i zwrócić na stojak dla zwierząt.</li>
<li>Następnego dnia należy sprawdzić, czy u myszy nie występuje krwawienie z pochwy, skurcze brzucha i/lub ogólne oznaki rozstroju, co wskazuje na aborcję. W takim przypadku należy natychmiast uśmiercić mysz. Zadbane futro i ogólny zdrowy wygląd świadczą o pomyślnej rekonwalescencji po operacji. Wstrzyknięte zarodki mogą zostać pobrane w fazie embrionalnej lub po urodzeniu do dalszych analiz. Jeśli wirus wykazuje ekspresję genu reporterowego, takiego jak ludzka fosfataza zasadowa (PLAP) lub GFP, barwienie ujawni obszary pozytywnej infekcji wirusowej (Rycina 1C).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Wstrzyknięte embriony można uśmiercić od 1-2 dni po iniekcji aż do osiągnięcia przez nie wieku dorosłego. Jeśli wirus wykazuje ekspresję genu reporterowego, takiego jak PLAP lub GFP, to ekspresja reportera służy do identyfikacji komórek zainfekowanych wirusem oraz ich klonów. Na przykład na rysunku 1C przedstawiono przekrój tkanki mózgu postnatalnego, który został zainfekowany in utero w dniu E9.5 wektorem retrowirusowym wykazującym ekspresję PLAP. Zainfekowane komórki są widoczne jako fioletowe skupiska po barwieniu histochemicznym. Poza identyfikacją komórek zainfekowanych wirusem, ekspresja reportera pozwala na badanie morfologii i położenia komórek, a także statusu ekspresji genów.
 <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Proces edycji genów z wykorzystaniem ultradźwięków i zestawu do mikroiniekcji; obraz ultradźwiękowy zarodka myszy; histologia neocortex." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Iniekcja wirusowa do komór przedmózgowia myszy w stadium E9.5. A. Zznieczone zwierzę zostaje umieszczone na stole do iniekcji. Dwa zarodki są odsłaniane i ustawiane pod głowicą ultradźwiękową w wskazanym miejscu (strzałka). Igła do mikroiniekcji wypełniona wirusem znajduje się w pobliżu zarodków i jest wyrównana z głowicą ultradźwiękową. B. Zrzut ekranu obrazu ultradźwiękowego w czasie rzeczywistym z zarodka myszy w stadium E9.5. V, komora; AS, pęcherzyk owodniowy; UW, ściana macicy. C. Zarodki zostały wstrzyknięte wirusem wykazującym ekspresję PLAP w stadium E10.5. Barwienie histochemiczne na PLAP ujawnia miejsca infekcji wirusowej.

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Wstrzyknięcia wirusowe z prowadzeniem ultradźwiękowym mogą być przeprowadzane w okresie od E8.5 do E11.5, przy czym w dniu E8.5 możliwe jest wstrzyknięcie wyłącznie do pęcherza owodniowego, natomiast od E9.5 do E11.5 można wstrzykiwać zarówno do pęcherza owodniowego, jak i do układu komorowego. Przy prawidłowym wykonaniu cząsteczki wirusowe wstrzyknięte do układu komorowego z prowadzeniem ultradźwiękowym mają dostęp do komórek wyścielających ten układ, a w konsekwencji mogą infekować różne struktury przedmózwia (neokortex, jądra podstawy, wzgórgowie, oko itp.), śródmózwia oraz tyłomózgu (Rysunek 1C). Wirus wstrzyknięty do pęcherza owodniowego ma dostęp do komórek znajdujących się na zewnętrznej powierzchni zarodka. Oprócz wirusów prowadzenie ultradźwiękowe może być również wykorzystane do wstrzykiwania komórek do rozwijającego się zarodka. Dzięki temu technika ta oferuje wiele możliwości wyboru (okres rozwoju, struktura, wirusy/komórki) podczas projektowania eksperymentu.
Kluczowe jest, aby wstrzyknięty wirus lub komórki wyrażały gen reporterowy, co umożliwia łatwą identyfikację komórek zainfekowanych/wstrzykniętych. Historycznie stosowano ludzką fosfatazę alkaliczną łożyska (PLAP) lub GFP. Z doświadczenia wiemy, że PLAP może być bardzo użytecznym genem reporterowym, ponieważ zarówno barwienie histochemiczne, jak i immunohistochemiczne PLAP daje wyraźne i ostry sygnał w pojedynczych komórkach, co pozwala na analizę morfologii i położenia komórek oraz przeprowadzenie analizy klonalnej. Ponieważ wirusowa ekspresja GFP może być słaba, reporter GFP może nie być idealny do barwienia tkanek, ale jest przydatny, jeśli celem jest uzyskanie pojedynczych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).

<table><tbody><tr><td>Mikromanipulator </td><td>Narishige International</td><td>91084361683D</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt do pipety HI-7</td><td>Narishige International</td><td>9108436141</td><td></td></tr><tr><td>ramię wsporcze 10 mm</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>9108436206</td><td></td></tr><tr><td>podkładka bazowa IP z żelaza</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>9108436167</td><td></td></tr><tr><td>Złącze CI-1 dla uchwytu pipety</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>9108436257</td><td></td></tr><tr><td>przewód o średnicy wewnętrznej 1 mm</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>911013</td><td></td></tr><tr><td>trójdrożny kurek z przyłączem Luer-Lock (opakowanie 10 szt.)</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler silników, 2-4 osie</td><td>Newport Corp.</td><td>860-c2</td><td></td></tr><tr><td>Joystick</td><td>Newport Corp.</td><td>PMC200-J</td><td></td></tr><tr><td>Adapter mikrometryczny</td><td>Newport Corp.</td><td>ADAPT-BM17-375</td><td></td></tr><tr><td>Napęd zmotoryzowany</td><td>Newport Corp.</td><td>CMA-25CC</td><td></td></tr><tr><td>Zespół przewodów</td><td>Newport Corp.</td><td>860I-10</td><td></td></tr><tr><td>stół translacyjny 25 mm</td><td>Newport Corp.</td><td>UMR8-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr</td><td>Newport Corp.</td><td>BM17-25</td><td></td></tr><tr><td>Płyta podstawowa</td><td>Newport Corp.</td><td>M-PBN8</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzny wspornik montażowy</td><td>Newport Corp.</td><td>EQ80-I</td><td></td></tr><tr><td>Zewnętrzny uchwyt montażowy</td><td>Newport Corp.</td><td>EQ80-E</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do manualnego wstrzykiwania/odsysania</td><td>Stoelting Co.</td><td>51222</td><td></td></tr><tr><td>25 &amp;mu;mikrostrzykawka</td><td>Stoelting Co.</td><td>51113</td><td></td></tr><tr><td>24&quot;x12&quot;x0,5&quot; płyta pomiarowa</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-640</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw stopek z regulacją wysokości</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT34-841</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt soczewki typu prętowego</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-669</td><td></td></tr><tr><td>Kątowy zacisk do stabilizacji postu</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT53-357</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; uchwyt do probówek</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-646</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#8221; stojak stalowy</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT36-499</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;#8221; stojak stalowy</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT36-503</td><td></td></tr><tr><td>zestaw śrub imbusowych 12 szt./opak., 1/4-20 x 1/2&quot;</td><td>Edmund Scientific</td><td>NT03-644</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do szkiełek</td><td>Fisher Scientific</td><td>Liczne opcje</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki dwustronne</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe średnica zewnętrzna (O.D.): 1,0 mm, średnica wewnętrzna (I.D.): 0,05 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 1 cm³ U-100 27G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator automatycznych klipsów</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Klamry chirurgiczne, 9 mm (do zamknięcia nacięcia skóry)</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Szwy jedwabne 5.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-1173</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Sterilube</td><td>Fera pharmaceuticals</td><td>48102-012-35</td><td></td></tr><tr><td>środek dezynfekujący MB-10 lub równoważny</td><td>Quip labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór wybielacza</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&quot;Do tej procedury można wykorzystać jeden z poniższych mikroskopów do obrazowania rozproszenia wstecznego ultradźwięków. Chociaż w filmie użyto modelu P40 firmy Paradigm-Medical, urządzenie P40 nie jest już dostępne w sprzedaży i zostało zastąpione modelem P60, który ma podobną cenę i może być stosowany w tych samych zastosowaniach. Dodatkowe materiały opisane w sekcji budowy platformy są przeznaczone do użytku z urządzeniami Paradigm-Medical. System Vevo 2100 jest wyposażony w sprzęt do obrazowania małych zwierząt.&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;&lt;strong&gt;BioMikroskop ultradźwiękowy P60&lt;/strong&gt; (UBM) firmy Paradigm-Medical&lt;br/&gt;(&lt;a href=&quot;http://www.paradigm-medical.com/ubms.html&quot;&gt;http://www.paradigm-medical.com/ubms.html&lt;/a&gt;).&lt;/li&gt;&lt;li&gt;&lt;strong&gt;Vevo 2100&lt;/strong&gt; od firmy VisualSonics (&lt;a href=&quot;http://www.visualsonics.com/&quot;&gt;http://www.visualsonics.com/&lt;/a&gt;)&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Środki znieczulające i przeciwbólowe&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Roztwór Nembutalu (wstrzykiwalny pentobarbital sodu w stężeniu 50 mg/ml; wytwarzany przez Abbott laboratories) można nabyć w firmie Bulter Schein Animal Health. Należy pamiętać, że jest to substancja kontrolowana z grupy II, której nabycie wymaga licencji Drug Enforcement Agency (DEA).&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;Roztwór bupiwakainy (0,25%; produkowany m.in. przez Hospira, Inc.) można nabyć od wielu dystrybutorów, w tym od Moore Medical.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu e9.5 pod kontrolą ultradźwięków

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

Wewnątrzmacicznie Operacje chirurgiczne z przeżyciem u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. Jednak ze względu na nieprzezroczystość ściany macicy w fazie wczesnej embriogenezy, możliwość celowania w konkretne części zarodka w celu mikroiniekcji jest znacznie ograniczona. Na szczęście obrazowanie wysokoczęstotliwościowym ultradźwiękami pozwala na generowanie obrazów, które mogą być wykorzystywane w czasie rzeczywistym do naprowadzania igły do mikroiniekcji do interesującego regionu zarodka. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie takiego obrazowania do naprowadzania iniekcji wektorów retrowirusowych do układu komorowego przedmózgowia myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E9.5). Metoda ta wykorzystuje laparotomię w celu uzyskania dostępu do rogów macicy oraz specjalnie zaprojektowaną płytkę, która pozwala na kąpiel zarodków gospodarza w soli fizjologicznej podczas ich obrazowania i iniekcji. Pomyślne operacje często skutkują przeżyciem większości lub wszystkich wstrzykniętych zarodków do dowolnego późniejszego, interesującego punktu czasowego (w okresie embrionalnym lub postnatalnym). Opisane tutaj zasady można zastosować z niewielkimi modyfikacjami w celu wykonania iniekcji do płynu owodniowego zarodków w fazie E8.5 (co umożliwia infekcję wzdłuż przednio-tylnego zasięgu cewy nerwowej, która nie uległa jeszcze zamknięciu) lub do układu komorowego mózgu w fazie E10.5/11.5. Ponadto w środkowym okresie neurogenezy (~E13.5) obrazowanie ultradźwiękowe może być wykorzystane do naprowadzania iniekcji do konkretnych obszarów mózgu w celu infekcji wirusowej lub transplantacji komórek. Wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego do naprowadzania iniekcji in utero u myszy jest bardzo potężną techniką, która umożliwia molekularną i komórkową manipulację zarodkami myszy w sposób, który w przeciwnym razie byłby wyjątkowo trudny, jeśli nie niemożliwy.

In utero operacje przeżycia u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości do prowadzenia iniekcji wektorów retrowirusowych do mózgu myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E).

Mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu E9.5 pod kontrolą ultradźwięków

Chirurgiczne zabiegi przeżycia in utero u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. Jednakże, ze względu na nieprzezroczystość ściany macicy ...

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie wektorów retrowirusowych do przedniego mózgu myszy przed rozpoczęciem neurogenezy w tym obszarze. Metoda ta umożliwia transdukcję komórek strefy zarodkowej genami budzącymi zainteresowanie. Tą samą metodą można wprowadzić inne wektory wirusowe lub komórki.Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw laparotomii u znieczulonej ciężarnej myszy, co umożliwia dostęp do embrionów. Drugim krokiem procedury jest umieszczenie ciężarnej myszy na stole do iniekcji pod przetwornikiem ultradźwiękowym. Następnie należy ustawić embriony na płytce w celu przeprowadzenia iniekcji.Trzecim krokiem procedury jest wykorzystanie obrazu ultrasonograficznego w czasie rzeczywistym do naprowadzenia igły do mikroiniekcji na miejsce docelowe wstrzyknięcia. Zarodki są wstrzykiwane seryjnie, aż do uzyskania pożądanej liczby. Ostatnim etapem procedury jest wyjęcie myszy z aparatu do iniekcji oraz zamknięcie nacięć w ścianie ciała, mięśniach i skórze.Następnie pozwala się zwierzęciu na regenerację. W rezultacie można uzyskać dane wskazujące lokalizację i cechy fenotypowe zainfekowanych komórek poprzez detekcję danego genu reporterowego w przekrojach tkanek oraz znakowanie markerami specyficznymi dla danego typu komórek. Cześć, jestem Taryn Pier Fois z laboratorium Nicka Guyano w programie Neurogeneration w Johns Hopkins University School of Medicine.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykorzystującą obrazowanie ultradźwiękowe do prowadzenia mikroiniekcji wektorów retrowirusowych do mózgu myszy in utero w 9,5 dniu embrionalnym. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać wpływ manipulacji ekspresją genów podczas rozwoju mózgu na zachowanie neuroblastów oraz komórek progenitorowych i ich specyfikację. Zapraszamy do oglądania.Jeśli iniekcje mają zawierać zmodyfikowane wektory wirusowe, procedurę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy bezpieczeństwa biologicznego 2. Umieść znieczuloną ciężarną mysz na grzbiecie. Za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości jednej cala wzdłuż linii środkowej.Odciąć tkankę łączną znajdującą się pomiędzy skórą a mięśniami otaczającymi miejsce nacięcia. Następnie, za pomocą pęsety, wykonać nieco krótsze nacięcie przez mięsień brzuszny. Delikatnie wyciągnąć rogi macicy.Zapisz liczbę embrionów po każdej stronie. Przenieś zwierzę na pleksiglasowy stół do iniekcji, aby chronić embriony.Wprowadź większość rogów macicy z powrotem do organizmu zwierzęcia, pozostawiając odsłonięte tylko dwa sąsiednie zarodki. Użyj 10 centymetrowej szalki Petriego z dwoma małymi otworami po pinezkach i otworem o średnicy dwóch centymetrów w centrum, uszczelnionym kawałkiem membrany scholastycznej, aby utrzymać zarodki w wilgoci. Użyj pęsety, przesuwając ją lekko przez membranę scholastyczną.Obniż naczynie nad matką. W miarę obniżania naczynia chwyć tkankę macicy pomiędzy dwoma wybranymi embrionami i delikatnie wyciągnij je przez błonę, gdy naczynie zostanie osadzone.Przymocuj go za pomocą dwóch pinezek, wbijając je przez mniejsze otwory w wosk. Napełnij naczynie 1x PBS o temperaturze 37°C, aby zapobiec wysychaniu embrionów. Ustaw embriony równolegle do osi długiej matki.Umieść platformę do mikroiniekcji pod głowicą sondy ultradźwiękowej. Obniż sondę do odległości około dwóch do trzech milimetrów nad embrionami. Aby uzyskać wyraźne obrazy USG, kluczowe jest, aby głowica sondy nie uderzała w embriony podczas oscylacji w przód i w tył.Podczas zbierania obrazów należy połączyć igłę z mikrostrzykawką o pojemności 25 µL zamontowaną w ręcznej pompie infuzyjno-wyciągowej. Umieść ściętą i zaostrzoną igłę do mikroiniekcji w uchwycie do pipety. Wywierając lekki nacisk na strzykawkę 10 cc wypełnioną olejem mineralnym w górnej części kurka stopowego, przepłucz olej przez rurki, uchwyt igły do mikroiniekcji oraz samą igłę, a następnie nabierz olej do mikrostrzykawki.Należy upewnić się, że nie wprowadzono pęcherzyków powietrza. Naciągnij do igły pęcherzyk powietrza o długości od jednego do dwóch milimetrów. Aby zachować separację między olejem mineralnym a wirusem, użyj pompy naciągowej, aby ostrożnie pobrać do igły roztwór wirusa.Naciągnij roztwór płynnym i powolnym ruchem, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Umieść załadowaną igłę w pozycji mikromanipulatora w obszarze iniekcji, dbając o to, by nie uszkodzić jej na embrionach lub sondzie ultradźwiękowej.Przesuń igłę do iniekcji w pozycję jeden do dwóch milimetrów od ściany macicy. Pod kątem około 45 stopni obrazy generowane przez sondę ultradźwiękową są wizualizowane na monitorze wideo. Końcówka igły pojawia się na ekranie jako najjaśniejszy punkt.Upewnij się, że kierunek oscylacji sondy jest równoległy do długości igły. Korzystając z obrazu ultrasonograficznego na monitorze wideo, ustaw embrion tak, aby obszar docelowy, w tym przypadku czwarta komora mózgu, był wyraźnie widoczny i dostępny dla igły. Dopasuj docelowy obszar mózgu do kierunku wprowadzania igły.Używając mikromanipulatora, przesuń końcówkę igły tak, aby delikatnie dotknęła ściany macicy. Szybkim ruchem pchnij igłę do przodu, aby przebić tkankę macicy. Może być konieczne wykonanie kilku podobnych pchnięć, aby przebić worek owodniowy i wstrzyknąć zarodkowi odpowiednią objętość wirusa.W przypadku prawidłowej iniekcji do komory dostaje się drobnoziarnista mgiełka, a przestrzeń komorowa może nieznacznie się rozszerzyć; przed wstrzyknięciem kolejnego zarodka należy wycofać igłę o około pięć milimetrów. Po wstrzyknięciu obu zarodków należy za pomocą pęsety przeciągnąć kolejne dwa zarodki przez błonę scholastyczną i wprowadzić wstrzyknięte zarodki z powrotem do jamy brzusznej. Po wstrzyknięciu i przesunięciu do jamy brzusznej pożądanej liczby zarodków, należy przenieść mysz ze stanowiska do iniekcji na podkład chłonny.Aby zamknąć nacięcie, należy pozwolić zwierzęciu na rekonwalescencję w czystej, ogrzewanej klatce. Ten zrzut ekranu obrazu z ultrasonografii w czasie rzeczywistym zarodka myszy w stadium E 9.5 pokazuje różne cechy anatomiczne, które mogą służyć do prowadzenia iniekcji. Tutaj V oznacza komorę, a uw ścianę macicy w obrębie pęcherzyka owodniowego.Igła do iniekcji to jasny punkt po prawej stronie obrazu. Na tym obrazie embrion, w który wstrzyknięto wirusa wykazującego ekspresję A-P-L-A-P, wykazuje obecność komórek zainfekowanych wirusem i pozytywnych pod kątem PLAP w obrębie rozwijającego się mózgu. Kilka tygodni po infekcji ekspresja reportera umożliwia badanie morfologii i położenia komórek, a także analizę klonalną.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić mikroiniekcję wektora retrowirusowego do embrionów myszy in utero w 9,5 dniu embrionalnym pod kontrolą USG. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby działać szybko, ponieważ przeżywalność jest wyższa, im krótszy jest czas manipulacji myszą podczas operacji. Należy również pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z materiałami niebezpiecznymi biologicznie, takimi jak wektory retrowirusowe.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ultradźwiękowo kierowana mikroiniekcja do przodomózgowia myszy in utero w 9,5 dniu ciąży

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania ultradźwiękowych mikropęcherzykowych środków kontrastowych do żywych, izolowanych mysich zarodków w późnym stadium ciąży. Metoda ta umożliwia badanie parametrów perfuzji i naczyniowych markerów molekularnych w obrębie zarodka za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości ze wzmocnieniem kontrastowym.

Obrazowanie kontrastowe w zarodkach myszy za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj mikroiniekcję wektorów retrowirusowych do przodomózgowia myszy pod kontrolą ultradźwięków w macicy przy E9,5. Ta metoda umożliwia precyzyjną manipulację ekspresją genów w komórkach macierzystych podczas rozwoju mózgu.

Mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu E9.5 pod kontrolą ultradźwięków

Przeglądaj więcej filmów