Mikroiniekcja pod kontrolą ultradźwięków do przodomózgowia myszy w macicy przy E9,5

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wektorów retrowirusowych do przodomózgowia myszy przed wystąpieniem neurogenezy w tym regionie. Metoda ta pozwoli na transdukcję komórek strefy rozrodczej z genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Inne wektory lub komórki wirusowe mogą być również wstrzykiwane tą metodą.

Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw laparotomii na znieczulonej ciężarnej myszy, która umożliwia dostęp do zarodków. Drugim etapem zabiegu jest umieszczenie ciężarnej myszy na etapie iniekcji pod głowicą ultrasonograficzną. Następnie umieść zarodki na płytce do wstrzyknięcia.

Trzecim etapem zabiegu jest wykorzystanie obrazu ultrasonograficznego w czasie rzeczywistym do skierowania igły do mikroiniekcji w miejsce docelowe wstrzyknięcia. Zarodki wstrzykuje się seriami, aż do osiągnięcia pożądanej liczby. Ostatnim etapem zabiegu jest wyjęcie myszy z aparatu iniekcyjnego i zamknięcie nacięć w ścianie ciała, mięśniach i skórze.

Następnie zwierzę może dojść do siebie. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują lokalizację i cechy fenotypowe zakażonych komórek poprzez wykrycie danego genu reporterowego w skrawkach tkanki i znakowanie markerami specyficznymi dla typu komórki. Cześć, nazywam się Taryn Pier Fois i pracuję w laboratorium Nicka Guyano na kierunku Neurogeneracja w Johns Hopkins University School of Medicine.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę wykorzystującą obraz ultrasonograficzny do kierowania mikrowstrzyknięciem wektorów retrowirusowych do mózgu myszy w macicy w 9,5 dniu embrionalnym. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do zbadania wpływu manipulowania ekspresją genów podczas rozwoju czterech mózgów na zachowanie komórek nerwowych macierzystych i progenitorowych oraz specyfikację siarczanów. Więc zacznijmy.

Jeśli zastrzyki mają zawierać zmodyfikowane wektory wirusowe, procedura powinna być wykonywana w dwóch kabinach bezpieczeństwa biologicznego. Połóż znieczuloną ciężarną mysz na jej grzbiecie. Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wykonać jednocalowe podłużne nacięcie przez skórę w linii środkowej.

Odetnij tkankę łączną znajdującą się między skórą a mięśniem otaczającym nacięcie. Następnie wykonaj nieco krótsze nacięcie mięśnia brzucha za pomocą kleszczy. Delikatnie wyciągnij rogi macicy.

Zapisać liczbę zarodków z każdej strony. Przenieś zwierzę do etapu iniekcji pleksi. Aby chronić zarodki.

Umieść większość rogów macicy z powrotem w zwierzęciu, pozostawiając odsłonięte tylko dwa sąsiednie zarodki. Użyj 10-centymetrowej szalki Petriego z dwoma małymi otworami na pinezki i dwucentymetrowym otworem środkowym uszczelnionym kawałkiem błony scholastycznej, aby zarodki były wilgotne. Za pomocą kleszczy lekko przeciśniętych przez błonę szkolną.

Opuść naczynie nad matką. Gdy naczynie jest opuszczane. Chwyć tkankę macicy między dwoma wybranymi zarodkami i delikatnie przeciągnij je przez błonę, gdy naczynie zostanie wysiane.

Zabezpiecz go dwoma pinezkami przez mniejsze otwory i do wosku. Napełnij naczynie temperaturą 37 stopni Celsjusza, jeden XPBS, aby zarodki były wilgotne. Ustaw zarodki równolegle do długości matki.

Umieścić stopień iniekcji pod sondą ultradźwiękową. Opuść sondę do około dwóch do trzech milimetrów nad zarodkami. Aby uzyskać wyraźne obrazy ultrasonograficzne, ważne jest, aby głowica sondy nie uderzała w zarodki, gdy oscyluje w przód iw tył.

Zbierając obrazy, podłącz igłę do mikrostrzykawki o pojemności 25 mikrolitrów zamontowanej w ręcznej pompie do pobierania infuzji. Umieścić skośną i zaostrzoną igłę do mikroiniekcji w uchwycie na pipety. Lekko docisnąć strzykawkę o pojemności 10 cm3 wypełnioną olejem mineralnym w górnej części kurka odcinającego, aby wypłukać olej do rurki, uchwytu igły do mikroiniekcji i igły, a następnie wciągnąć olej do mikrostrzykawki.

Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza. Wciągnąć z powrotem pęcherzyk powietrza o długości od jednego do dwóch milimetrów do igły. Aby utrzymać separację między olejem mineralnym a wirusem, należy użyć pompy pobierającej, aby ostrożnie naładować igłę roztworem wirusa.

Narysuj roztwór płynnie i powoli i zwracaj uwagę, aby uniknąć zatkania. Umieścić załadowaną igłę w pozycji manipulatora mikrom w obszarze wstrzyknięcia. Uważając, aby nie złamać go na zarodkach lub sondzie ultrasonograficznej.

Przesunąć igłę do wstrzykiwań w miejsce oddalone o jeden do dwóch milimetrów od ściany macicy. Pod kątem około 45 stopni obrazy generowane przez sondę ultradźwiękową są wizualizowane na monitorze wideo. Końcówka igły jest wyświetlana jako najjaśniejszy punkt na ekranie.

Upewnij się, że kierunek oscylacji sondy jest równoległy do długości igły. Korzystając z obrazu ultrasonograficznego na monitorze wideo, ustaw zarodek w taki sposób, aby obszar docelowy, w tym przypadku cztery komory mózgu, był dobrze widoczny i dostępny dla igły. Wyrównaj docelowy obszar mózgu z kierunkiem posuwania się igły.

Użyj mikromanipulatora, aby końcówka igły dotknęła ściany macicy. Szybko wbij igłę do przodu, aby przeniknąć do tkanki macicy. Wiele podobnych szczepień może być koniecznych do przeniknięcia do worka owodniowego, a do mózgu wstrzyknąć zarodkowi odpowiednią ilość wirusa.

W udanym wstrzyknięciu do komory dostaje się mgiełka cząstek stałych, a przestrzeń komorowa może się nieznacznie rozszerzyć, wycofaj igłę z powrotem o około pięć milimetrów przed wstrzyknięciem następnego zarodka. Po wstrzyknięciu obu zarodków należy użyć kleszczy, aby przeciągnąć kolejne dwa zarodki przez błonę scholastycznymi i zwrócić wstrzyknięte zarodki do jamy brzusznej. Po wstrzyknięciu żądanej liczby zarodków i wepchnięciu ich z powrotem do jamy brzusznej, należy przenieść mysz z etapu wstrzyknięcia na wkładkę chłonną.

Aby zamknąć nacięcie, pozwól zwierzęciu dojść do siebie w czystej, ocieplonej klatce. Ten zrzut ekranu obrazu ultrasonograficznego w czasie rzeczywistym z zarodka myszy E 9.5 pokazuje różne cechy anatomiczne, które można wykorzystać do kierowania wstrzyknięciami. Tutaj V to komora jako worek owodniowy, a uw ściana macicy.

Igła do wstrzykiwań to jasny punkt po prawej stronie obrazu. Na tym zdjęciu zarodek, któremu wstrzyknięto wirusa eksprymującego A-P-L-A-P, pokazuje PLAP-dodatnie, zakażone wirusem komórki w rozwijającym się mózgu. Kilkutygodniowa ekspresja reporterowa po zakażeniu pozwala na zbadanie morfologii i pozycji komórki, a także analizę klonalną.

Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać mikroiniekcję wektora retrowirusowego pod kontrolą USG do zarodków myszy w macicy w 9,5 dniu embrionalnym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o szybkim poruszaniu się, ponieważ przeżycie jest tym bardziej prawdopodobne, im mniej czasu mysz jest manipulowana podczas operacji. Ważne jest również, aby pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas używania materiałów niebezpiecznych biologicznie, takich jak wektory retrowirusowe.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.