Name: Przezcewkowa indukcja zakażenia dróg moczowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę przezcewkowej indukcji zakażenia dróg moczowych u myszy, obejmującą przygotowanie szczepów bakteryjnych, inokulację i analizę próbek. Protokół umożliwia ilościowe określenie zakażenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Shelly Xie oraz Jennifer Payne za ekspercką pomoc techniczną. Praca ta była możliwa dzięki grantom przyznanym przez Society of Pediatric Urology oraz Stanford Pediatric Research Fund.

I. Przygotowanie cewników moczowych
<ol>
	<li>W przypadku każdego pęcherza i nerki myszy przeznaczonych do pobrania próbek, umieść odpowiednio w jednej probówce kriogenicznej 5-6 kulek ze stali nierdzewnej (dla pęcherza, rozmiar 1,6 mm lub mieszanka 0,9-2,0 mm) lub kulek z tlenku cyrkonu (dla nerki, rozmiar 0,5 mm). Probówki z kulkami poddaj autoklawowaniu.</li>
	<li>Po ostygnięciu probówek do temperatury otoczenia, dodaj 20 µL sterylnego PBS do każdej probówki zawierającej kulki ze stali nierdzewnej oraz 40 µL sterylnego PBS do każdej probówki zawierającej kulki z tlenku cyrkonu.</li>
	<li>Przygotowujemy cewniki moczowe zgodnie z opisem Hunga i Hultgrena13. Autoklawuj czystą parę pęsety płaskiej oraz precyzyjne nożyczki (typu irydowego lub podobne) i pozwól instrumentom ostygnąć do temperatury otoczenia. Przetrzyj powierzchnie kaptury z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem. W kapturze odetnij odcinek rurki polietylenowej o długości ok. 30 cm. Aseptycznie nałóż sterylną igłę o rozmiarze 30 G (długość 1/2 cala) na sterylną strzykawkę 3 cc. Chwyć jeden koniec odciętej rurki polietylenowej za pomocą autoklawowanej pęsety i nasuń rurkę na igłę aż do piasty. Odetnij rurkę tak, aby około 2 cm wystawało poza końcówkę igły. Wyjmij cewnik ze strzykawki i umieść go w sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji krzyżowej, przygotowujemy jeden cewnik dla każdej myszy. Po przygotowaniu wszystkich cewników wysterylizuj je, wystawiając w nieprzykrytej szalce Petriego na promieniowanie UV przez co najmniej 30 minut. Nie patrz bezpośrednio w lampy UV i nie wystawiaj żadnej części ciała w kapturze podczas ich działania. Po naświetlaniu UV cewniki można przechowywać przez dłuższy czas w szalce Petriego. Zalecamy uszczelnienie szalki Parafilmem, aby pomóc zachować sterylność.</li>
</ol>
II. Inokulacja zwierząt
<ol>
	<li>Myszy powinny trafić do laboratorium co najmniej tydzień przed rozpoczęciem manipulacji eksperymentalnych, aby uniknąć stresogennych czynników zakłócających. Wykorzystuje się samice myszy, ponieważ cewka moczowa samców jest niezwykle trudna do kaniulacji. CBA/J to powszechnie stosowana, podatna na ZUM inbredowa linia myszy. Należy używać myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, ponieważ jest to okno dojrzałości immunologicznej przed wystąpieniem starzenia się organizmu. Pierwszego dnia eksperymentu należy zanurzyć końcówkę sterylnej pętli szczepielniczej w fiolce z zamrożonym stokiem bakterii. Zebrać niewielką ilość inokulum i wysiać je na odpowiednią płytkę z agarem. Zazwyczaj bakterie uropatogenne E. coli (UPEC) oraz inne szczepy można hodować przez noc na agarze Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37°C w powietrzu otoczenia. Szczepy UPEC rosną w postaci stałych, żółto-białych, półprzezroczystych kolonii na agarze LB. Natychmiast przenieś zapas bakterii z powrotem do zamrażarki. Szczepy bakterii uropatogennych mogą z czasem tracić zjadliwość w wyniku wielokrotnych, seryjnych pasażowań. Dlatego zaleca się wysiewanie nowej płytki z agarem przed każdym eksperymentem.</li>
	<li>W drugim dniu eksperymentu, po potwierdzeniu prawidłowej morfologii kolonii, należy wyizolować pojedyncze kolonie z płytek agarowych i przenieść je do co najmniej 5 ml pożywki płynnej na noc. W przypadku większości szczepów bakterii uropatogennych można stosować bulion LB (37°C, 20 obr./min w powietrzu otoczenia). Nakrętki probówek z pożywką płynną należy pozostawić lekko poluzowane, aby umożliwić napowietrzanie.</li>
	<li>W 3. dniu eksperymentu należy pobrać 10% pierwszej hodowli w pożywce płynnej i ponownie inkubować w pożywce płynnej przez noc (zazwyczaj 37°C oraz 20 obr./min), aby zwiększyć ekspresję pili typu I. Seryjne hodowle w bulionie pomagają zoptymalizować uropatogenność bakterii, ponieważ wykazano, że pili typu I są krytycznym czynnikiem wirulencji dla uropatogenów in vivo1. Nakrętki probówek z kulturą w bulionie należy pozostawić lekko poluzowane, aby umożliwić napowietrzanie.</li>
	<li>W 4. dniu eksperymentu zmierz wartość OD600 hodowli płynnej z 3. dnia. Jeśli nie jest to znane dla badanego szczepu bakteryjnego, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne z wysiewem na płytki w zakresie co najmniej 7 logów (rozcieńczenia wykonane w PBS, hodowle na agarze LB, 37°C inkubacja przez noc) w celu określenia zależności między OD600 oraz jcf/ml. Przyjmując ogólną zasadę, wartość OD600 wynosząca 0,4–0,5 zazwyczaj odpowiada wartości 1–2x107 jtk na 50 mikrolitrów. Gdy zostanie ustalona zależność między OD600 a po wyznaczeniu wartości jtk/ml można dostosować kulturę w bulionie do wartości OD600 odpowiadającej pożądanej liczbie jtk na mysz w 50 mikrolitrach PBS. W niektórych pracach zasugerowano, że inokulacja 10 mikrolitrów, a nie 50, prowadzi do mniejszego cofania się płynu do nerek6. Jednak większość publikacji donosi o stosowaniu 50 mikrolitrów na mysz. Zazwyczaj pożądana liczba jtk mieści się w zakresie od 10^6 do 10^8 jtk/mysz, jednak każda kombinacja szczepu bakteryjnego i linii myszy wymaga empirycznego sprawdzenia. in vivo.</li>
	<li>Aby zapobiec natychmiastowemu wydaleniu inokulum po instylacji, myszy powinny być pozbawione wody przez co najmniej 30 minut przed wprowadzeniem w znieczulenie ogólne. Innym kluczowym zabiegiem jest doprowadzenie do mikcji przed indukcją znieczulenia poprzez chwycenie myszy za kark i delikatne uciśnięcie dolnej części brzucha. Bezpieczną dawką indukcyjną dla 8–12-tygodniowych samic myszy szczepu CBA jest 2–2,5% izofluranu, a następnie podtrzymanie znieczulenia przy użyciu 1,8–2% izofluranu.</li>
	<li>Po uzyskaniu znieczulenia myszy ułożone są w pozycji wyprostowanej na plecach, z głową umieszczoną w masce nosowej podłączonej do tlenu z izofluranem. Dolną część brzucha masuje się, aby opróżnić pęcherz moczowy z moczu. Jeśli pęcherz jest względnie pusty, ten zabieg może nie przynieść efektu. Dolną część brzucha oraz krocze przemywa się 70% etanolem.</li>
	<li>Do pobrania pożądanej ilości inokulum bakteryjnego używa się sterylnej strzykawki o pojemności 1 cm³ bez igły. Następnie na strzykawkę w sposób aseptyczny nakłada się sterylny cewnik moczowy. Nadmiar rurki cewnika odcina się nożyczkami tak, aby dystalnie od końcówki igły pozostało jedynie 1–2 milimetry rurki. Następnie należy opukać strzykawkę i w pozycji pionowej wcisnąć tłok, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Porcję bakteriostatycznego żelu nawilżającego wyciska się na sterylną płytkę Petriego lub wewnętrzną stronę sterylnego opakowania strzykawki. Końcówkę cewnika (z przymocowaną strzykawką) zanurza się w żelu. W przypadku testowania wielu szczepów bakteryjnych w ramach jednego eksperymentu należy uważać, aby nie używać tej samej kropli żelu do nawilżania cewników zawierających różne szczepy.</li>
	<li>Przy użyciu stereomikroskopu (zakres powiększeń od 0,8x do 5x) sromowe przysłony łyszeczki łonecznej znieczulonej myszy są delikatnie chwytane niedominującą ręką za pomocą pęsety z drobnymi zębami i uniesione w kierunku głowowym, aby odsłonić ciemnoróżowy ujście cewki moczowej (Rycina 1). Strzykawka (z dołączonym cewnikiem) jest trzymana w dominującej ręce chwytem pisarskim, a końcówka cewnika zostaje wprowadzona do ujścia cewki moczowej pod kątem 45 stopni. Przysłona łyszeczki łonecznej jest rozciągana wzdłuż osi podłużnej strzykawki, co w efekcie „nakłada” cewkę moczową na cewnik. Manewr ten jest niezbędny, ponieważ cewka moczowa myszy jest nadmiarowa. Cewnik powinien łatwo wsunąć się do pęcherza (aż do stopki, Rycina 2); można go delikatnie obracać, aby pomóc w pokonaniu nadmiarowych fałdów cewki moczowej. Po dotarciu cewnika do stopki strzykawkę można opuścić, aż znajdzie się ona równolegle do osi podłużnej ciała myszy. Niedominująca ręka może zwolnić pęsetę, aby pomóc w stabilizacji pozycji cewnika i strzykawki, podczas gdy dominująca ręka jest wykorzystywana do powolnego wstrzykiwania inokulum (przez co najmniej 5 sekund). Jeśli podczas wtryskiwania widoczny jest wyciek płynu wokół cewnika, oznacza to, że pęcherz jest pełny lub cewnik znajduje się w pochwie (bezpośrednio za cewką moczową). Wtryskiwanie należy natychmiast przerwać i dokładnie sprawdzić położenie cewnika. Jeśli cewnik znajdował się w cewce moczowej, dana mysz nie powinna być włączona do eksperymentu. Z kolei cewnik błędnie wprowadzony do pochwy można repositionować i ponownie podjąć próbę wstrzyknięcia. Po zakończeniu procedury cewnik i strzykawka są powoli wycofywane z organizmu myszy.</li>
	<li>Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wczesnego mikczenia po inokulacji, który może doprowadzić do usunięcia podanych bakterii i w konsekwencji do zmiennego poziomu infekcji, niektórzy badacze utrzymują myszy w znieczuleniu przez 30 minut po inokulacji przezcewkowej10. Po zabiegu myszy powinny regenerować się na czystym termoforze/podgrzewaczu pod ciągłą obserwacją w celu potwierdzenia powrotu do prawidłowego rytmu oddychania i aktywności. Po całkowitym odzyskaniu zdolności do pełzania zwierzęta mogą zostać przeniesione do klatek z podścieliskiem.</li>
</ol>
III. Pomiar CFU w zakażonej tkance
<ol>
	<li>W różnych publikacjach dotyczących infekcji dróg moczowych (UTI) u myszy zgłaszano wyniki hodowli od 6 godzin do jednego tygodnia lub dłużej po inokulacji. Optymalne punkty czasowe muszą zostać określone empirycznie dla każdej kombinacji szczepu bakteryjnego i szczepu myszy. Mocz oddany naturalnie pobiera się do hodowli, trzymając mysz za kark nad sterylną płytką Petriego. Zebrany mocz powinien być przez cały czas przechowywany w lodzie. Może być konieczne przeprowadzenie wielu prób pobrania moczu w ciągu wielu godzin, ponieważ oddawanie moczu przez myszy jest częste, odbywa się w małych objętościach (30-10 microliters na raz) i zależy od poziomu stresu zwierzęcia.</li>
	<li>Po pobraniu próbek moczu oddanego naturalnie, uśmiercamy myszy przy użyciu izofluranu i zwichnięcia kręgów szyjnych. Brzuszek otwiera się aseptycznie. Jeśli wcześniej nie udało się pobrać próbki moczu oddanego naturalnie, niewielką ilość moczu można często aspiratorowo pobrać przez ścianę pęcherza za pomocą strzykawki z igłą 30G.</li>
	<li>Wycinamy jedną lub obie nerki, siekamy je na co najmniej 4 części (każda część powinna ważyć mniej niż 50 micrograms) na sterylnej płytce Petriego i umieszczamy w probówkach kriogenicznych zawierających kulki cyrkonowe oraz PBS, przechowywanych w lodzie. Wycinamy pęcherz moczowy, siekamy go na co najmniej 4 części i umieszczamy w probówkach kriogenicznych zawierających kulki ze stali nierdzewnej oraz PBS, przechowywanych w lodzie. Probówki z tkanką, kulkami i PBS umieszczamy w homogenizatorze Bullet Blender i homogenizujemy tkanki przy ustawieniu prędkości „8” przez jedną minutę. Po homogenizacji często pozostają niektóre fragmenty tkanki. Dopóki można pipetować 50-10 microliters ciekłego homogenatu, fragmenty stałe nie stanowią problemu. Jeśli czas homogenizacji zostanie wydłużony dla niektórych próbek, jest krytyczne, aby zrobić to dla wszystkich tkanek w celu zachowania spójności procesu. Używamy homogenizatora Bullet Blender, ponieważ zapobiega on możliwości kontaminacji krzyżowej, jest szybszy niż przetwarzanie poszczególnych próbek jedna po drugiej za pomocą standardowego homogenizatora i nie powoduje znacznego nagrzewania homogenizowanych próbek.</li>
	<li>W płytce mikrotitracyjnej należy wykonać co najmniej dwa lub trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia zebranego moczu i homogenatów tkankowych. W przypadku eksperymentów wstępnych zasadne może być wykonanie co najmniej siedmiu dziesięciokrotnych rozcieńczeń. Do odpowiedniego agaru wysiewa się do 10 microliters moczu, homogenatów pęcherza i/lub nerek. Ponieważ objętość próbek moczu może być ograniczona, konieczne może być uzupełnienie ich objętości do 100 microliters przed wykonaniem dziesięciokrotnych rozcieńczeń. Jeśli jest to wymagane, początkowe rozcieńczenie (przed rozcieńczeniem dziesięciokrotnym) musi zostać uwzględnione w końcowych obliczeniach wydajności bakteryjnej. Preferujemy hodowlę UPEC na agarze z błękitem metylenowym i eozyną lub agarze MacConkey (inkubacja nocna w 37°C), ponieważ podłoża te są selektywne dla organizmów Gram-ujemnych. Szczepy UPEC rosną na agarze MacConkey jako centralnie pęknięte, czerwono-różowe kolonie ze względu na zdolność do fermentacji laktozy.</li>
	<li>Po nocnej inkubacji należy policzyć cfu dla każdej płytki. W przypadku próbek rozcieńczanych seryjnie, za najbardziej dokładny uznaje się wynik z płytki o rozcieńczeniu zawierającym 50-10 kolonii. Należy obliczyć wstecznie cfu na tkankę, na milligram tkanki lub na ml.</li>
</ol>
IV. Reprezentatywne wyniki

<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="Próbka tkanki ssaczej z raną do analizy histologicznej; obraz mikroskopowy do badania komórkowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Zewnętrzny otwór cewki moczowej (tkanka ciemnoróżowa) odsłonięty poprzez uniesienie wobecu kaptura łoneczkowego pęsetą (powyżej górnej krawędzi zdjęcia)

<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="Procedura wstrzykiwania substancji zwierzętom, zbliżenie; strzykawka, eksperymentalny, badawczy, badanie biomedyczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Cewnikowana cewka moczowa. Rozdwojony łysik jest widoczny bezpośrednio nad cewnikiem.
<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="Wykres liczby bakterii, jtk/ml, skala logarytmiczna, analiza mikrobiologiczna, pomiar wzrostu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3. Liczba jednostek tworzących kolonie (CFU) w pęcherzu 2 dni po zakażeniu przezcewkowym 8-tygodniowych samic myszy CBA/J szczepem uropatogennym E. coliPęcherze poddano homogenizacji, a liczbę jtk/ml określono poprzez seryjne rozcieńczenia i posiew na agar MacConkey. Romby wskazują liczbę jtk/ml dla poszczególnych myszy, pozioma kreska oznacza medianę jtk/ml.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Indukcja zakażenia dróg moczowych u myszy poprzez przezcewkowe inokulowanie bakterii jest uznaną, lecz wymagającą technicznie procedurą11. Hung i Hultgren opublikowali niedawno doskonały przegląd technik przezcewkowych indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy13. W niniejszej pracy staramy się dokładniej omówić szczegóły tego podejścia eksperymentalnego.

Osoby początkujące mogą ćwiczyć technikę, wykonując laparotomię po linii środkowej w celu odsłonięcia pęcherza, wst...

<table><tbody><tr><td>Probówki kriogeniczne, 2,0 ml, polipropylenowe (bez nakrętek)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki do probówek kriogenicznych, z pierścieniem uszczelniającym &amp;rsquo;O&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator kuleczkowy (Bullet Blender)</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki z tlenku cyrkonu (0,5 mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki ze stali nierdzewnej (1,6 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka kuleczek ze stali nierdzewnej (0,9-2,0 mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Myszy CBA/J, samice w wieku 8-12 tygodni</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (NaCl 137mM, KCl 2,7mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4,3mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1,4mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>Agar LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB (broth)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>Pętlaki do posiewu</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>Proszek do przygotowania agaru z eozyną i błękitem metylenowym (EMB)</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>Proszek do przygotowania agaru MacConkeya</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Proszek do przygotowania agaru LB</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Przeźroczyste polietylenowe rurki Intramedic, PE10 [średnica wewnętrzna 0,28 mm (0,011 cala); średnica zewnętrzna 0,61 mm (0,024 cala)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Igły 30G, 1/2 cala</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa 1 ml, Slip-Tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml Luer-Lock</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Badane szczepy bakterii uropatogennych hoduje się na agarze. Zazwyczaj bakterie uropatogenneE. coli(UPEC) oraz inne szczepy mogą być hodowane przez noc na agarze Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37°C w powietrzu atmosferycznym. Szczepy UPEC rosną na agarze LB w postaci żółtawo-białych, półprzezroczystych kolonii. Po potwierdzeniu odpowiedniej morfologii kolonii, pojedyncze kolonie są następnie przekładane do hodowli w pożywce płynnej. Pożywka LB może być stosowana dla większości uropatogennych szczepów bakteryjnych. W celu zwiększenia ekspresji pili typu I, będących dobrze zdefiniowanym czynnikiem wirulencji bakterii uropatogennych, można zastosować dwie seryjne, nocne hodowle w pożywce płynnej LB. Hodowle w pożywce płynnej są rozcieńczane do pożądanego stężenia w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Samice myszy w wieku od 8 do 12 tygodni poddaje się znieczuleniu izofluranem i inokuluje bakterie przez cewkę moczową, używając strzykawek 30G z rurkami polietylenowymi. Typowe dawki inokulacyjne, które muszą zostać określone empirycznie dla każdej kombinacji szczepu bakteryjnego i myszy, wynoszą 106do 108cfu na mysz w 10 do 50 µL PBS. Po pożądanym okresie zakażenia (od jednego dnia do kilku tygodni) pobiera się próbki moczu, pęcherz oraz obie nerki. Każdy organ jest rozdrabniany, umieszczany w PBS i homogenizowany w homogenizatorze Blue Bullet. Homogenaty moczu i tkanek są rozcieńczane seryjnie w PBS i wysiewane na odpowiedni agar. Następnego dnia zlicza się jednostki tworzące kolonie.

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Badane szczepy bakterii uropatogennych hoduje się na agarze. Zazwyczaj uropatogenne szczepy E. coli (UPEC) oraz inne szczepy można hodować przez noc na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transuretralna indukcja zakażenia dróg moczowych u myszy. Jest to osiągane poprzez uprzednie namnożenie interesujących szczepów bakteryjnych i rozcieńczenie kultur do pożądanego stężenia. Drugim krokiem procedury jest transuretralna inokulacja pęcherza moczowego myszy interesującymi szczepami bakteryjnymi.Trzecim krokiem procedury jest pobieranie próbek moczu oraz wycinanie nerek i pęcherzy moczowych. Ostatnim etapem procedury jest wysiew moczu oraz homogenizatów próbek nerek i pęcherzy na płytki agarowe. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące udaną infekcję dróg moczowych na podstawie obecności kolonii bakteryjnych w wysiewach.Witam, nazywam się Michael Shea i zapraszam do mojego laboratorium w Departamencie Urologii w Stanford University School of Medicine. Jestem Annu, również z laboratorium Shea. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę cewnikowania przezcewkowego u myszy.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania indukcji zakażenia dróg moczowych u myszy. Przejdźmy zatem do realizacji. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odetnij 30 centymetr odcinka rurki polietylenowej, a następnie zamocuj igłę 30G w sterylnej strzykawce o pojemności trzech centymetrów sześciennych.Za pomocą sterylnej pęsety chwyć jeden koniec odciętej rurki i nasuń ją na igłę, aż dotrze ona do nasady. Odetnij rurkę tak, aby wystawała ona około dwóch centymetrów poza końcówkę igły. Pomaga to zapobiec obrażeniom myszy podczas kanulacji.Wyjąć cewnik z strzykawki i umieścić go w sterylnej płytce Petriego. Przygotować jeden cewnik dla każdej myszy, która ma zostać zainfekowana. Sterylizować cewniki za pomocą promieniowania ultrafioletowego przez co najmniej 30 minut.Zapiecznić naczynie za pomocą Parafilmu, aby zachować sterylność cewnika podczas długotrwałego przechowywania. Wysiać odpowiednią płytkę agarową szczepionką z mrożonego zapasu interesującego szczepu bakteryjnego. W tym przypadku szczepionka Uropatogennej E. coli lub UPEC jest wysiewana w celu inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C.Wybierz pojedyncze kolonie o odpowiedniej morfologii, które w przypadku UPEC są stałymi, żółtawymi, półprzezroczystymi koloniami na agarze LB, i umieść je w co najmniej pięciu mililitrach pożywki płynnej do inkubacji nocnej w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 obr./min. Dodaj 10% pierwszej kultury z pożywki do świeżego medium i inkubuj przez noc. Ponownie, aby zwiększyć ekspresję fimbrii typu jeden, która jest związana z patogenezą urogenitalną in vivo, zmierz OD 600 kultury w celu określenia liczby jednostek tworzących kolonie.Skrót od jednostek tworzących kolonie (CFU) na mililitr hodowli. Rozcieńcz hodowlę w sterylnym 1x PBS tak, aby końcowe stężenie wynosiło od 10⁶ do 10⁸ CFU w 10–50 µL, aby zapobiec natychmiastowemu wydaleniu inokulatu. Po instalacji odstaw myszom wodę na 30 minut przed znieczuleniem, chwyć mysz za kark i delikatnie uciśnij dolną część brzucha, aby pobudzić do oddania moczu.Zanurz znieczuczoną mysz na plecach, umieszczając jej głowę w stożku nosowym podłączonym do tlenu z izofluranem. Masuj brzuch, aby opróżnić pęcherz moczowy z resztek moczu. Za pomocą butelki z atomizerem namocz dolną część brzucha i krocze 70% ethanolem.Następnie za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml należy pobrać inokulum bakteryjne. Do strzykawki należy przymocować przygotowany sterylny cewnik. Za pomocą nożyczek należy przyciąć rurkę tak, aby wystawała ona tylko od 1 do 2 mm poza końcówkę igły.Pomaga to zapobiec obrażeniom myszy podczas cewnikowania; należy opukać strzykawkę i wcisnąć tłok. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, nasmarować cewnik, zanurzając go w niewielkiej ilości bakteriostatycznego żelu nawilżającego. Należy pamiętać o użyciu osobnej porcji żelu dla każdego szczepu bakterii, który będzie badany pod stereomikroskopem sekcyjnym.Używając pęsety o drobnych ząbkach w niedominującej dłoni, delikatnie chwyć i unieś woreczek łoneczny, aby odsłonić ciemnoróżowy otwór cewki moczowej w dominującej dłoni. Chwyć strzykawkę z podłączonym cewnikiem. Trzymając strzykawkę jak ołówek, wprowadź końcówkę cewnika do otworu cewki moczowej pod kątem 45 stopni względem brzucha myszy.W połozeniu strzałkowym w płaszczyźnie środkowej. Rozciągnąć uprzewlekę łyski łysiczki wzdłuż długiej osi strzykawki. Skutecznie wprowadzić cewnik do cewki moczowej.Cewnik powinien łatwo wsunąć się do pęcherza, jeśli zajdzie taka potrzeba. Delikatnie obracaj cewnik, aby ułatwić przejście przez fałdy cewki moczowej. Gdy cewnik zostanie wprowadzony do poziomu zespołu, opuść strzykawkę równolegle do brzucha myszy.Odłóż pęsetę i użyj niedominującej ręki, aby ustabilizować cewnik i strzykawkę. Powoli wstrzyknij inokulum w czasie co najmniej pięciu sekund. Jeśli podczas wstrzykiwania widać wyciek płynu wokół cewnika, oznacza to, że pęcherz jest pełny lub cewnik znajduje się w pochwie.Przerwij wtryskiwanie i sprawdź położenie cewnika. W razie potrzeby skoryguj położenie cewnika w cewce moczowej. Po zakończeniu wtryskiwania powoli wyjmij cewnik.Utrzymaj mysz w znieczuleniu przez pół godziny po inokulacji. Aby zmniejszyć ryzyko wydalania po zabiegu, pozwól myszy dojść do siebie na czystym kocu grzewczym pod ciągłą obserwacją w celu potwierdzenia powrotu do prawidłowego rytmu oddechowego i aktywności. Po całkowitym wybudzeniu i odzyskaniu zdolności do poruszania się, przenieś mysz do klatki z podścieliskiem.W zależności od kombinacji szczepów bakteryjnych i myszy, pełna infekcja może potrwać od sześciu godzin do tygodnia. W celu przeprowadzenia procedury, w ciągu kilku godzin należy przygotować dla każdej zainfekowanej myszy sterylną szalkę Petriego umieszczoną w lodzie. Należy unieruchomić mysz karkiem nad szalką, aby zebrać mocz do hodowli.Wystarczająca powinna być objętość 50 µL moczu. Przenieść mocz pipetą do probówki do mikrocentryfugi, zamknąć ją i przechowywać mocz w lodzie. Pod stereomikroskopem umieścić uśpioną mysz na grzbiecie na tacy sekcyjnej.Spryskaj brzuch 70% etanolem. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie skóry i leżącej pod nią ściany brzucha o długości od trzech do czterech centymetrów. W razie potrzeby użyj szpilek, aby odsunąć ścianę brzucha od zawartości jamy brzusznej.Jeśli wcześniejsze próby pobrania moczu nie powiodły się, należy użyć igły 30 G i strzykawki, aby odessać mocz bezpośrednio przez ścianę pęcherza. Za pomocą pęsety i nożyczek należy usunąć nerki. Przenieść je do sterylnej szalki Petriego i posiekać każdą z nich na co najmniej cztery kawałki o wielkości około dwóch do trzech milimetrów każdy.Przenieś każdy fragment nerki do probówki kriogenicznej zawierającej od pięciu do sześciu sterylnych kulek z tlenku cyrkonu o średnicy 0,5 mm oraz 400 µL sterylnego PBS. Próbki nerek należy przechowywać w lodzie. Za pomocą pęsety i nożyczek usuń pęcherz moczowy.Rozdrobnij pęcherz moczowy, stosując tę samą metodę co w przypadku nerek. Przenieś każdy fragment pęcherza do probówki kriogenicznej zawierającej stalowe kulki o średnicy 1,6 millimeter oraz 200 µL sterylnego PBS i przechowuj probówki w lodzie. Umieść probówki w homogenizatorze typu bullet blender i homogenizuj tkankę przy ustawieniu prędkości na stopień ósmy przez co najmniej jedną minutę.Często po homogenizacji pozostają fragmenty tkanek. Wszystkie próbki należy homogenizować przez ten sam czas w płytce mikrotytrakcyjnej. Należy przygotować seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne zebranego moczu i homogenatu tkankowego w lodzie.Rozprowadzenie zimnego PBS. Zakończenie rozcieńczania. Odpowiednie płytki z agarem inkubowane przez noc w temperaturze 37 °C.Liczbę CFU na narząd, miligram tkanki lub mililitr moczu można obliczyć wstecz na podstawie liczby kolonii na każdej płytce. Stosujemy te techniki do badania, w jaki sposób mutacje w odpowiedziach bakterii na stres wpływają na zdolność UPEC do wywoływania ZUM in vivo, a także na oporność na antybiotyki podawane zakażonym myszom. Tabela ta przedstawia zdolność UPEC typu dzikiego do zakażania pęcherza myszy po inokulacji przezcewkowej.Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić przezskórną indukcję infekcji dróg moczowych u myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ostrożnie cewnikować myszy. Właściwa technika ułatwia cewnikowanie, lecz może wymagać wprawy.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przetoczeniowe wywołanie infekcji dróg moczowych u myszy

Źródło: Luyts, N. i inni. Podłużna kontrola infekcji dróg moczowych i ich leczenia u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje indukcję i śledzenie infekcji dróg moczowych w modelu mysim z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli wstrzykniętego do pęcherza, gdzie zachodzi adhezja, inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa bakterii. Światło emitowane z bioluminescencyjnego operonu służy jako wskaźnik w czasie rzeczywistym obciążenia bakteryjnego podczas...

Wizualizacja infekcji dróg moczowych w modelu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji

Źródło: Conover, M. S. i in., J. Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszym. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje procedurę montażu i wszczepienia cewnika transurethralnego u samicy myszy, po czym następuje szczepienie bakteryjne w celu wywołania zakażenia dróg moczowych związanych z cewnikami oraz badania interakcji gospodarza z patogenem wygenerowanym przez biofilm.

Zakażenie dróg moczowych związane z cewnikami w modelu mysim

Źródło: Conover, M. S. i in., Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje wykrywanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC) w tkance pęcherza myszy zakażonej Escherichia coli ekspresującą β-galaktozydazę. Po utrwaleniu tkanek, permeabilizacji i barwieniu X-gal, IBC pojawiają się jako niebieskie punkty pod mikroskopem rozcinającym, co potwierdza inwazję bakterii podczas infekcji dróg moczowych.

Wizualizacja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych w zakażonym pęcherzu myszy

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Inkraplanie przezcewkowe jest trudną procedurą i nie zostało dobrze opisane w literaturze. Celem pracy jest opisanie techniki przezcewkowego wprowadzania cewnika do dopęcherzowego podawania płynów z substancjami czynnymi do pęcherza moczowego i/lub prostaty u dorosłych samców myszy.

Procedura wkraplania przezcewkowego u dorosłego samca myszy

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Poznaj metodę przezcewkowej indukcji zakażenia dróg moczowych u myszy, obejmującą przygotowanie szczepów bakteryjnych, inokulację i analizę próbek. Protokół umożliwia ilościowe określenie zakażenia.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Przeglądaj więcej filmów