Name: Test aktywacji GTPazy RhoC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę pull down assay do pomiaru aktywnego RhoC GTPazy w komórkach. Ta technika umożliwia ilościową analizę aktywności białka i pozwala badać jego rolę w sygnałowaniu komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ministerstwo Obrony USA (Dept. of Defense) W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 oraz W81XWH-08-1-0356

1. Przygotowanie białka fuzyjnego GST
<ol>
 <li>Przygotowano zapasy glicerynowe kompetentnych bakterii JM109 zawierających pierwsze 90 aminokwasów N-końca domeny wiążącej Rho (RBD) rhotekiny, subklonowanych do wektora pGEX3x w miejscach BamH1/EcoR1. 
 
 Aby zapewnić wysoką wydajność, w każdym eksperymencie NALEŻY wykonać następujące kroki. W naszym doświadczeniu świeżo przygotowany GST-RBD jest kluczowy dla uzyskania powtarzalnego i dokładnego testu aktywacji GTPazy.</li>
 <li>Do 50 mL pożywki LB z ampicyliną (LB amp) dodać 50 μL (w przybliżeniu, nie rozmrażać) zapasu glicerynowego i inkubować przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.</li>
 <li>Rozcieńczyć 1:10 w 500 mL pożywki LB-amp i hodować przez 1 h.</li>
 <li>Indukować produkcję białka GST za pomocą 0,1 mM IPTG przez 2 h.</li>
 <li>Równomiernie rozdzielić do probówek do wirowania i odwirować w rotorze Sorval GSA3 przy 5000 RPM w temperaturze 4°C przez 20 min.</li>
 <li>Resuspender osad w probówkach do wirowania w 10 mL buforu do lizy*. 
 *Bufor do lizy bakterii: 20% sacharozy, 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM Na2S2O5, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT; dodać świeży PMSF, benzamid, aprotininę i leupeptynę.</li>
 <li>Sonicować przez 2-3 min (zależnie od typu sonikatora; używamy urządzenia Fischer Sonic Dismembranator Model 500 ustawionego na wartość 6, cykl 50%).</li>
 <li>Wirować w wirówce Sorvall SS34 przez 20 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C. Na tym etapie można pobrać niewielką alikwot i poddać analizie SDS-PAGE. Żel można zbarwić Coomassie; prążek powinien być widoczny przy 46 kDa.</li>
 <li>Usunąć supernatant i dodać 1 mL 50% zawiesiny glutation-Sepharose 4B.</li>
 <li>Inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C przy rotacji. Przemyć 3 razy buforem do lizy.</li>
 <li>Resuspender kulek GST-RBD/glutation-Sepharose do uzyskania 50% zawiesiny (około 1 mL) przy użyciu buforu GST-fish**. **Bufor GST-Fish: 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl2; dodać świeży PMSF, benzamid, aprotininę i leupeptynę.</li>
</ol>
2. Test wytrącania z użyciem białek fuzyjnych GST
<ol>
 <li>Użyj 5-10 x 106 komórek na analizę</li>
 <li>Przemyj komórki raz w lodowatym PBS, przechowuj płytki w lodzie (stosujemy płaskie szalki szklane wypełnione lodem) i poddaj lizie za pomocą 0,5 mL buforu GST-fish.</li>
 <li>Inkubuj przez 5 min w lodzie, zbierz komórki za pomocą gumowej skóry (rubber policeman) lub płaskiego skrobaka, przenieś do probówki do mikrowirówki i wiruj przy 20 000 obr./min przez 5 min w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Odlej 50 μL w celu oznaczenia całkowitej ilości Rho (tj. związanej z GDP + GTP).</li>
 <li>Dodaj 0,5 mL kulek GST-RBD/glutation-Sepharose i inkubuj w temperaturze 4°C przez noc z rotacją.</li>
 <li>Przemyj 6x buforem GST-fish.</li>
 <li>Resuspenduj kulki w 40 μL 2x-buforu do próbek Laemmliego 
 Na tym etapie należy oznaczyć stężenie całkowitego białka Rho w alikwocie pobranym w punkcie 2.4 i przygotować 30 μg do naniesienia na żel wraz z odpowiadającą próbką aktywacji.</li>
 <li>Gotuj próbki w temperaturze 90°C przez 5 min, wiruj krótko i pobierz supernatant (aby uniknąć kulek), a następnie nanieś i rozdziel na żelu SDS-PAGE 4-20% gradientowym w 12 studzienkach.</li>
 <li>Prowadź elektroforezę przy napięciu nie wyższym niż 150 V, przenieś białka na membranę przy użyciu buforu Towbina i stałego prądu 100 W.</li>
 <li>Zablokuj membranę 5% roztworem mleka w TBST i inkubuj z przeciwciałem specyficznym dla RhoC.</li>
</ol>

3. Reprezentatywne wyniki
W przypadku prawidłowych wyników powinien pojawić się pojedynczy prążek o masie około 22 kDa. Nieprawidłowe wyniki objawiają się obecnością wielu prążków lub wysokim tłem. Świadczy to o degradacji białka, niepełnym przemyciu próbek lub zastosowaniu starego GST-RBD.

<img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Analiza ekspresji białka RhoC-GTP; Western blot wykazujący prążki od niskiej do wysokiej ekspresji; kontrola aktyny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przedstawiono trzy oddzielne linie komórkowe wykazujące różne poziomy GTPazy RhoC, aby zademonstrować niskie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC, wysokie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC lub brak RhoC. Następnie błonę poddano procesowi strippingu i ponownie inkubowano z przeciwciałem przeciwko aktynie (genowi referencyjnemu), aby służyła jako kontrola ładowania dla całkowitego białka RhoC.
<img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Blot aktywacji GTPazy RhoC; analiza białek, wynik elektroforezy, badanie szlaku GTPazy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wielokrotne prążki lub wysokie tło wynikają z degradacji białek, niepełnego przemycia próbek lub zastosowania starego GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Najbardziej krytycznym etapem procedury jest otrzymywanie świeżego GST-RBD. Brak szczególnej uwagi poświęconej temu krokowi jest główną przyczyną niepowodzenia eksperymentu. Wszystkie etapy, od otrzymania GST-RBD (1.2) do inkubacji z lizatem komórkowym przez noc (2.5), powinny zostać wykonane w ciągu jednego dnia. Innym kluczowym krokiem jest upewnienie się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do przygotowania lizatów. Jest to szczególnie istotne w przypadku analizy RhoC GTPase, która wykazuje tendencję do wyst...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki glutation-sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Żele Criterion 4-20% Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

test aktywacji gtpazy rhoc

RhoC GTPase Activation Assay

GTPaza RhoC wykazuje 91% homologii do GTPazy RhoA. Ze względu na powszechność tej ostatniej w komórkach, opracowano wiele odczynników i technik dla GTPazy RhoA. Jednakże GTPaza RhoC jest wyrażana w komórkach nowotworowych przerzutowych na stosunkowo niskim poziomie. W związku z tym opracowano niewiele odczynników specyficznych dla RhoC. Zaadaptowaliśmy test aktywacji Rho w celu wykrywania GTPazy RhoC. Technika ta wykorzystuje białko fuzyjne domeny wiążącej GST-Rho do wyodrębnienia aktywnej GTPazy RhoC. Dodatkowo, na początku testu możemy pobrać całkowite białko, aby określić poziomy całkowitej GTPazy RhoC (związanej z GTP i GDP). Pozwala to na określenie stosunku aktywnej do całkowitej GTPazy RhoC w komórce. Opracowano kilka komercyjnych wersji tej procedury, jednak zestawy komercyjne są zoptymalizowane pod kątem GTPazy RhoA i zazwyczaj nie sprawdzają się w przypadku GTPazy RhoC. Zmodyfikowano niektóre elementy testu, a także opracowano przeciwciało specyficzne dla RhoC.

Niniejszy protokół wykorzystuje test pull-down do oznaczenia poziomów aktywnej GTPazy RhoC w komórkach.

Test aktywacji GTPazy RhoC

GTPaza RhoC wykazuje 91% homologii z GTPazą RhoA. Ze względu na powszechność tej ostatniej w komórkach, opracowano wiele odczynników i technik dedykowanych GTPazie RhoA. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test aktywacji RhoC GTPazy

Metoda przedstawiona w niniejszej publikacji opisuje test służący do monitorowania aktywacji specyficznych dla RhoA czynników wymiany GDP/GTP (GEFs) w hodowlach komórkowych, z wykorzystaniem zmutowanego białka fuzyjnego RhoA GST, które wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych GEFs. Białka GEFs są wytrącane z lizatów komórkowych, wykrywane za pomocą techniki Western blotting i ilościowo oznaczane metodą densytometrii.

Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Ten film demonstruje test konkursowy do badania partnerów białkowych wiążących GTPazę. Wykorzystując białko GTPazy związane z nukleotydami unieruchomione na kulkach magnetycznych, można badać konkurencyjne wiązanie między dwoma oddziałującymi partnerami białkowymi dla tego samego miejsca wiązania na GTPazie w celu oceny powinowactwa wiązania partnerów białkowych.

Test wiązania konkurencji w celu zbadania konkurujących partnerów białkowych wiążących GTPazę

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.

Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Ten raport opisuje badanie przesiewowe różnych detergentów do przygotowania wizualnego GPCR, rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go. Przedstawiono metody biochemiczne charakteryzujące jakość kompleksu na różnych etapach oczyszczania. Protokół ten można uogólnić na inne kompleksy białek błonowych dla ich przyszłych badań strukturalnych.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Poznaj metodę pull down assay do pomiaru aktywnego RhoC GTPazy w komórkach. Ta technika umożliwia ilościową analizę aktywności białka i pozwala badać jego rolę w sygnałowaniu komórkowym.

Test aktywacji GTPazy RhoC

Przeglądaj więcej filmów