Name: Test aktywacji GTPazy RhoC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę pull down assay do pomiaru aktywnego RhoC GTPazy w komórkach. Ta technika umożliwia ilościową analizę aktywności białka i pozwala badać jego rolę w sygnałowaniu komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ministerstwo Obrony USA (Dept. of Defense) W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 oraz W81XWH-08-1-0356

1. Przygotowanie białka fuzyjnego GST
<ol>
 <li>Przygotowano zapasy glicerynowe kompetentnych bakterii JM109 zawierających pierwsze 90 aminokwasów N-końca domeny wiążącej Rho (RBD) rhotekiny, subklonowanych do wektora pGEX3x w miejscach BamH1/EcoR1. 
 
 Aby zapewnić wysoką wydajność, w każdym eksperymencie NALEŻY wykonać następujące kroki. W naszym doświadczeniu świeżo przygotowany GST-RBD jest kluczowy dla uzyskania powtarzalnego i dokładnego testu aktywacji GTPazy.</li>
 <li>Do 50 mL pożywki LB z ampicyliną (LB amp) dodać 50 μL (w przybliżeniu, nie rozmrażać) zapasu glicerynowego i inkubować przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.</li>
 <li>Rozcieńczyć 1:10 w 500 mL pożywki LB-amp i hodować przez 1 h.</li>
 <li>Indukować produkcję białka GST za pomocą 0,1 mM IPTG przez 2 h.</li>
 <li>Równomiernie rozdzielić do probówek do wirowania i odwirować w rotorze Sorval GSA3 przy 5000 RPM w temperaturze 4°C przez 20 min.</li>
 <li>Resuspender osad w probówkach do wirowania w 10 mL buforu do lizy*. 
 *Bufor do lizy bakterii: 20% sacharozy, 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM Na2S2O5, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT; dodać świeży PMSF, benzamid, aprotininę i leupeptynę.</li>
 <li>Sonicować przez 2-3 min (zależnie od typu sonikatora; używamy urządzenia Fischer Sonic Dismembranator Model 500 ustawionego na wartość 6, cykl 50%).</li>
 <li>Wirować w wirówce Sorvall SS34 przez 20 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C. Na tym etapie można pobrać niewielką alikwot i poddać analizie SDS-PAGE. Żel można zbarwić Coomassie; prążek powinien być widoczny przy 46 kDa.</li>
 <li>Usunąć supernatant i dodać 1 mL 50% zawiesiny glutation-Sepharose 4B.</li>
 <li>Inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C przy rotacji. Przemyć 3 razy buforem do lizy.</li>
 <li>Resuspender kulek GST-RBD/glutation-Sepharose do uzyskania 50% zawiesiny (około 1 mL) przy użyciu buforu GST-fish**. **Bufor GST-Fish: 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl2; dodać świeży PMSF, benzamid, aprotininę i leupeptynę.</li>
</ol>
2. Test wytrącania z użyciem białek fuzyjnych GST
<ol>
 <li>Użyj 5-10 x 106 komórek na analizę</li>
 <li>Przemyj komórki raz w lodowatym PBS, przechowuj płytki w lodzie (stosujemy płaskie szalki szklane wypełnione lodem) i poddaj lizie za pomocą 0,5 mL buforu GST-fish.</li>
 <li>Inkubuj przez 5 min w lodzie, zbierz komórki za pomocą gumowej skóry (rubber policeman) lub płaskiego skrobaka, przenieś do probówki do mikrowirówki i wiruj przy 20 000 obr./min przez 5 min w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Odlej 50 μL w celu oznaczenia całkowitej ilości Rho (tj. związanej z GDP + GTP).</li>
 <li>Dodaj 0,5 mL kulek GST-RBD/glutation-Sepharose i inkubuj w temperaturze 4°C przez noc z rotacją.</li>
 <li>Przemyj 6x buforem GST-fish.</li>
 <li>Resuspenduj kulki w 40 μL 2x-buforu do próbek Laemmliego 
 Na tym etapie należy oznaczyć stężenie całkowitego białka Rho w alikwocie pobranym w punkcie 2.4 i przygotować 30 μg do naniesienia na żel wraz z odpowiadającą próbką aktywacji.</li>
 <li>Gotuj próbki w temperaturze 90°C przez 5 min, wiruj krótko i pobierz supernatant (aby uniknąć kulek), a następnie nanieś i rozdziel na żelu SDS-PAGE 4-20% gradientowym w 12 studzienkach.</li>
 <li>Prowadź elektroforezę przy napięciu nie wyższym niż 150 V, przenieś białka na membranę przy użyciu buforu Towbina i stałego prądu 100 W.</li>
 <li>Zablokuj membranę 5% roztworem mleka w TBST i inkubuj z przeciwciałem specyficznym dla RhoC.</li>
</ol>

3. Reprezentatywne wyniki
W przypadku prawidłowych wyników powinien pojawić się pojedynczy prążek o masie około 22 kDa. Nieprawidłowe wyniki objawiają się obecnością wielu prążków lub wysokim tłem. Świadczy to o degradacji białka, niepełnym przemyciu próbek lub zastosowaniu starego GST-RBD.

<img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig1.jpg" alt="Analiza ekspresji białka RhoC-GTP; Western blot wykazujący prążki od niskiej do wysokiej ekspresji; kontrola aktyny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przedstawiono trzy oddzielne linie komórkowe wykazujące różne poziomy GTPazy RhoC, aby zademonstrować niskie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC, wysokie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC lub brak RhoC. Następnie błonę poddano procesowi strippingu i ponownie inkubowano z przeciwciałem przeciwko aktynie (genowi referencyjnemu), aby służyła jako kontrola ładowania dla całkowitego białka RhoC.
<img src="/files/ftp_upload/2083/2083fig2.jpg" alt="Blot aktywacji GTPazy RhoC; analiza białek, wynik elektroforezy, badanie szlaku GTPazy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wielokrotne prążki lub wysokie tło wynikają z degradacji białek, niepełnego przemycia próbek lub zastosowania starego GST-RBD.

<ol><li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase%2C+a+novel+transforming+oncogene+for+human+mammary+epithelial+cells+that+partially+recapitulates+the+inflammatory+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype.</a> Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).</li>
<li>van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+overexpression+modulates+induction+of+angiogenic+factors+in+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells.</a> Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+RhoC+GTPase-induced+inflammatory+breast+cancer+phenotype+by+treatment+with+a+farnesyl+transferase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor.</a> Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).</li>
<li>Golen, K. L. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+activated+protein+kinase+pathway+is+involved+in+RhoC+GTPase+induced+motility%2C+invasion+and+angiogenesis+in+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).</li>
<li>Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoC+GTPase+is+required+for+PC-3+prostate+cancer+cell+invasion+but+not+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility.</a> Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).</li>
<li>Hall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+Collagen+receptor+%28alpha2beta1%29+signaling+promotes+prostate+cancer+cell+invasion+through+RhoC+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase.</a> Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).</li>
<li>Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+PC-3+prostate+cancer+cell+morphology%2C+invasion+and+tumor+cell+diapadesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).</li>
<li>van Golen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2+Induces+Prostate+Cancer+Transendothelial+Cell+Migration+via+Activation+of+the+Small+GTPase+Rac%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac.</a> J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).</li>
<li>Chatterjee, M., van Golen, K. L. Int J Cancer. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+downregulates+Rho+activity%3A+reciprocal+balance+between+both+GTPases+determines+cellular+morphology+and+migratory+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior.</a> J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Najbardziej krytycznym etapem procedury jest otrzymywanie świeżego GST-RBD. Brak szczególnej uwagi poświęconej temu krokowi jest główną przyczyną niepowodzenia eksperymentu. Wszystkie etapy, od otrzymania GST-RBD (1.2) do inkubacji z lizatem komórkowym przez noc (2.5), powinny zostać wykonane w ciągu jednego dnia. Innym kluczowym krokiem jest upewnienie się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do przygotowania lizatów. Jest to szczególnie istotne w przypadku analizy RhoC GTPase, która wykazuje tendencję do wyst...

<table><tbody><tr><td>Kuleczki glutation-sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Żele Criterion 4-20% Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0032</td><td></td></tr></tbody></table>

test aktywacji gtpazy rhoc

RhoC GTPase Activation Assay

GTPaza RhoC wykazuje 91% homologii do GTPazy RhoA. Ze względu na powszechność tej ostatniej w komórkach, opracowano wiele odczynników i technik dla GTPazy RhoA. Jednakże GTPaza RhoC jest wyrażana w komórkach nowotworowych przerzutowych na stosunkowo niskim poziomie. W związku z tym opracowano niewiele odczynników specyficznych dla RhoC. Zaadaptowaliśmy test aktywacji Rho w celu wykrywania GTPazy RhoC. Technika ta wykorzystuje białko fuzyjne domeny wiążącej GST-Rho do wyodrębnienia aktywnej GTPazy RhoC. Dodatkowo, na początku testu możemy pobrać całkowite białko, aby określić poziomy całkowitej GTPazy RhoC (związanej z GTP i GDP). Pozwala to na określenie stosunku aktywnej do całkowitej GTPazy RhoC w komórce. Opracowano kilka komercyjnych wersji tej procedury, jednak zestawy komercyjne są zoptymalizowane pod kątem GTPazy RhoA i zazwyczaj nie sprawdzają się w przypadku GTPazy RhoC. Zmodyfikowano niektóre elementy testu, a także opracowano przeciwciało specyficzne dla RhoC.

Niniejszy protokół wykorzystuje test pull-down do oznaczenia poziomów aktywnej GTPazy RhoC w komórkach.

Test aktywacji GTPazy RhoC

GTPaza RhoC wykazuje 91% homologii z GTPazą RhoA. Ze względu na powszechność tej ostatniej w komórkach, opracowano wiele odczynników i technik dedykowanych GTPazie RhoA. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test aktywacji RhoC GTPazy

Metoda przedstawiona w niniejszej publikacji opisuje test służący do monitorowania aktywacji specyficznych dla RhoA czynników wymiany GDP/GTP (GEFs) w hodowlach komórkowych, z wykorzystaniem zmutowanego białka fuzyjnego RhoA GST, które wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych GEFs. Białka GEFs są wytrącane z lizatów komórkowych, wykrywane za pomocą techniki Western blotting i ilościowo oznaczane metodą densytometrii.

Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Ten film demonstruje test konkursowy do badania partnerów białkowych wiążących GTPazę. Wykorzystując białko GTPazy związane z nukleotydami unieruchomione na kulkach magnetycznych, można badać konkurencyjne wiązanie między dwoma oddziałującymi partnerami białkowymi dla tego samego miejsca wiązania na GTPazie w celu oceny powinowactwa wiązania partnerów białkowych.

Test wiązania konkurencji w celu zbadania konkurujących partnerów białkowych wiążących GTPazę

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Ten raport opisuje badanie przesiewowe różnych detergentów do przygotowania wizualnego GPCR, rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go. Przedstawiono metody biochemiczne charakteryzujące jakość kompleksu na różnych etapach oczyszczania. Protokół ten można uogólnić na inne kompleksy białek błonowych dla ich przyszłych badań strukturalnych.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Badanie demonstruje ilościowy test oparty na PCR dla aktywacji szlaku sygnałowego Sonic Hedgehog (SHH) za pośrednictwem rzęsek za pomocą agonisty SHH w komórkowym modelu ciliogenezy.

Ilościowy test oparty na PCR do pomiaru sygnalizacji sonic hedgehog w komórkowym modelu ciliogenezy

Poznaj metodę pull down assay do pomiaru aktywnego RhoC GTPazy w komórkach. Ta technika umożliwia ilościową analizę aktywności białka i pozwala badać jego rolę w sygnałowaniu komórkowym.

Test aktywacji GTPazy RhoC

Przeglądaj więcej filmów