Name: Izolacja, wzbogacanie i utrzymanie komórek macierzystych rdzeniaka zarodkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji i utrzymania komórek macierzystych rdzeniaka zarodkowego z mysich modeli genetycznych. Technika ta zapewnia lepszy dostęp do składników odżywczych, zmniejszając spontaniczną różnicowanie i śmierć komórek w porównaniu do klasycznych metod neurosferowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantów Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), Childhood Brain Tumor Foundation oraz National Institutes of Health (NS042205).

1. Mikrodyssekcja móżdżku z guzem, dysocjacja tkanki nowotworowej i wysiew
<ol>
 <li>Pobieranie tkanki nowotworowej
 <ol>
 <li>Chore myszy z medulloblastomą często wykazywały zahamowanie wzrostu, wodogłowie oraz typowe objawy neurologiczne, w tym niedowład kończyn tylnych i brak zdolności do odzyskania równowagi po odwróceniu na grzbiet. W celu pobrania tkanki nowotworowej myszy należy uśmiercić poprzez inhalację dwutlenkiem węgla. Ważne jest, aby nie przeprowadzać dyslokacji odcinka szyjnego kręgosłupa, ponieważ procedura ta generuje nacisk na tylną część czaszki i może naruszyć integralność tkanki nowotworowej.</li>
 <li>Dekapitację przeprowadza się niezwłocznie po śmierci za pomocą nożyczek, usuwając w maksymalnym stopniu włosy i tkankę mięśniową w celu zapewnienia dobrej widoczności czaszki. Powierzchnię czaszki należy oczyścić chusteczką Kimwipe nasączoną 95% etanolem.</li>
 <li>Za pomocą precyzyjnych nożyczek należy wyciąć otwór wzdłuż linii środkowej czaszki, a następnie usunąć tkankę kostną za pomocą precyzyjnej pęsety, aż do całkowitego odsłonięcia mózgowia, w tym móżdżku z guzem.</li>
 <li>Podczas gdy móżdżki zdrowych osobników dorosłych wykazują wyraźnie zarysowane półkule i robaczek, móżdżki myszy z guzami są często powiększone, amorficzne, o gładkiej powierzchni i z wyraźnie widocznymi naczyniami krwionośnymi. Stosując techniki sterylne, należy pobrać guz móżdżku za pomocą pęsety i umieścić go w lodowatym PBS bez Mg2+ i Ca2+.2+.</li>
 </ol>
 
 Uwaga: wszystkie instrumenty są sterylizowane w 95% etanolu przed użyciem.</li>
 <li>Dysocjacja tkanki nowotworowej
 <ol>
 <li>Przenieść tkankę nowotworową z PBS do 50% Accutase (rozcieńczonego w PBS) w objętości około 4-krotnie większej niż objętość tkanki nowotworowej, posiekać tkankę drobnymi nożyczkami przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować w 37°C przez 4 minuty, po czym tkankę poddaje się powtarzającemu pipetowaniu za pomocą Pipetmana o objętości 1 ml przez kolejne 3 minuty. Metoda ta powinna pozwolić na uzyskanie mieszaniny pojedynczych komórek i niewielkich agregatów komórkowych.</li>
 <li>Rozcień zawiesinę komórkową trzykrotnie w PBS i wiruj przez 5 minut przy 1000 g, aby uzyskać osad komórkowy. Resuspenduj osad komórkowy w świeżej pożywce do hodowli neuralnych komórek macierzystych i wysiej na żelatynizowaną 60-milimetrową szalkę do hodowli tkankowych Primaria. Używamy szalek Primaria w celu zwiększenia adhezji podczas pierwszego wysiewu; kolejne pasażowania można przeprowadzać na zwykłych szalkach do hodowli tkankowych.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
Uwaga: Naczynia hodowlane należy pokryć 0,1% żelatyną przez co najmniej 30 minut. Przygotować świeże medium do hodowli komórek macierzystych neuronów, składające się z medium Neurobasal z glutaminą, Pen-Strep, N2, B27, ludzkim EGF (25 ng/ mL) i podstawowym FGF (25 ng/ mL).
2. Wzbogacanie, utrzymanie i ekspansja komórek nowotworowych medulloblastoma poprzez pasażowanie seryjne
Zazwyczaj po 1 tygodniu od początkowego wysiewu uzyskuje się liczne kolonie (Rycina 1). Kolonie te można dysocjować i ponownie wysiać na nowe żelatynizowane szalki w celu wzbogacenia populacji komórek nowotworowych. Najpierw należy wymienić pożywkę hodowlaną, a następnie użyć Pipetmana o objętości 1 mL, aby mechanicznie oddzielić kolonie, a następnie wielokrotnie pipetować przez 4 minuty w celu uzyskania zawiesiny komórkowej (nie jest wymagane użycie Accutase). Pod mikroskopem należy sprawdzić, czy duże skupiska komórek zostały zdysocjowane. Następnie zawiesinę komórkową nanosi się na nowe żelatynizowane szalki do dalszej hodowli i powtarza tę samą procedurę podczas kolejnych pasażowań. Nieprzytwierdzone komórki nowotworowe, komórki krwi oraz inne typy komórek są usuwane poprzez seryjne przesiewy, co pozwala na szybką ekspansję przytwierdzonych komórek nowotworowych. Pożywkę hodowlaną należy wymienić drugiego dnia po początkowym wysiewie, a następnie co drugi dzień.
3. Barwienie immunofluorescencyjne i badanie hodowlanych komórek
1. Hodowla komórek nowotworowych na szklanych zakryciach
W dniu 1. należy umieścić po jednej szklanej laseczce w każdej z sześciu studni płytki 6-dołkowej, a następnie dodać 0,1% żelatyny na 30 minut w temperaturze 37°C. Wysiać około 2-4X 105 komórek nowotworowych na mL. Komórki powinny przytwierdzić się przez noc, a pożywka dla neuronalnych komórek macierzystych powinna zostać wymieniona w dniu 3. Barwienie przeprowadza się w dniu 4.
2 Barwienie immunofluorescencyjne
Usunąć medium hodowlane i dwukrotnie przemyć komórki lodowatym PBS. Utrwalić komórki w świeżo przygotowanym 4% PFA przez 15 minut. Krótko przemyć komórki dwukrotnie PBS i poddać permeabilizacji za pomocą 0,3% Tritonu (w PBS) przez 5 minut. Krótko przemyć komórki dwukrotnie PBS i zablokować 10% surowicą kozią przez 40 minut. Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 90 minut, a następnie przemyć komórki trzykrotnie PBS, po 5 minut za każdym razem. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez 60 minut, a następnie przemyć trzykrotnie PBS, po 5 minut za każdym razem. Zamocować szkiełka nakrywkowe na preparatach przy użyciu 5 mL wodnego medium montażowego i wykonać mikroskopię konfokalną.
4. Dyferencjacją komórek nowotworowych
Usunąć pożywkę dla komórek macierzystych układu nerwowego i krótko przemyć komórki dwukrotnie za pomocą PBS. W 1. dniu dodać pożywkę różnicującą, w 4. dniu wymienić pożywkę, a w 7. dniu określić stopień różnicowania za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Pożywka różnicująca składa się z DMEM, Pen-Strep oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej.
5. Reprezentatywne wyniki
Wyniki morfologii
Poyobrobieniu Accutase i delikatnym, wielokrotnym pipetowaniu, tkanka nowotworowa powinna zostać w większości rozbita na małe agregaty komórkowe i pojedyncze komórki. Już 5 dni po początkowym wysiewaniu można zaobserwować wiele sporych kolonii, co przedstawiono na Rysunku 1. Silnie proliferujące komórki nowotworowe często mają kształt bipolarny z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy. Komórki te zazwyczaj promieniście rozchodzą się od małych agregatów komórkowych przytwierdzonych do żelatynizowanej powierzchni. Komórki krwi, małe i okrągłe, są zazwyczaj usuwane podczas kolejnych wymian pożywki i seryjnych wysiewów. Po kilku pasażach można zaobserwować równomiernie rozmieszczone, proliferujące komórki nowotworowe Ki67+ przy niewielkim zanieczyszczeniu innymi typami komórek (Rysunek 2).
Ekspresja markerów komórek macierzystych neuronów, analiza klonalna i różnicowanie w wiele linii komórkowych
Aby ustalić, czy komórki proliferujące pochodzące z rozdzielonej tkanki guza móżdżku wykazują cechy nowotworowych komórek macierzystych, przeprowadzono dalszą charakterystykę poprzez analizę ekspresji markerów komórek macierzystych, analizę klonalną oraz potencjał różnicowania. Stwierdzono, że wyizolowane komórki nowotworowe wykazują wysoką ekspresję markerów neuronalnych komórek macierzystych, takich jak Sox2 i Nestin (Rycina 3). Ponieważ tkanki pobrano z guza SmoM2-YFP, wszystkie komórki nowotworowe wykazują ekspresję YFP. Zgodnie z niedawnymi badaniami wskazującymi, że rzęski pierwotne są istotne dla rozwoju medulloblastoma zależnego od szlaku Shh 12, ekspresja SmoM2-YFP była wyraźnie zlokalizowana w rzęskach komórek nowotworowych Sox2+ (Rycina 3). Po wysianiu w gęstości klonalnej 300 komórek na mL podłoża hodowlanego zaobserwowano ekspansję klonalną z pojedynczej komórki nowotworowej do znacznej kolonii (Rycina 4). Ponadto komórki te były zdolne do różnicowania się w różne typy komórek neuronalnych i glejowych podczas hodowli w warunkach pro-różnicujących (Rycina 5).
<img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig1.jpg" alt="Wzrost hodowli komórkowej pod mikroskopem, przedstawiający gęstość i morfologię komórek w analizie badawczej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Morfologia silnie proliferującej kolonii po pierwszym wysiewie dysocjowanej tkanki medulloblastoma. Zazwyczaj w ciągu 5 dni od początkowego wysiewu dysocjowanej tkanki guza tworzy się obszerna kolonia, a reprezentatywny przykład przedstawiono tutaj w świetle przechodzącym. Dwubiegunowe, wydłużone komórki promieniują z gęstego agregatu komórek rdzennych. Do komórek nowotworowych przylegają małe, okrągłe erytrocyty, których liczba stopniowo maleje w wyniku seryjnych pasażowań.
<img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig2.jpg" alt="Mikroskopia hodowli komórkowych; po lewej: gęstość komórek, po prawej: immunofluorescence, Ki67, acetylated tubulin." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Morfologia ugruntowanych komórek medulloblastoma po więcej niż trzech pasażach. Ten obraz w polu jasnym przedstawia typowy wygląd ugruntowanych komórek medulloblastoma po kilku pasażach. Komórki pozostają głównie dwubiegunowe z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy. Przedstawiono barwienie acetylated tubulin komórek nowotworowych, z których większość znajduje się w cyklu komórkowym, co potwierdza silna ekspresja Ki67.
<img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig3.jpg" alt="Obrazowanie komórek z markerami YFP, Nestin i Sox2; mikroskopia fluorescencyjna, wizualizacja nałożona, badanie komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Ustanowione linie komórkowe medulloblastoma wykazują ekspresję markerów komórek macierzystych układu nerwowego. SmoM2-YFP znakuje komórki wykazujące ekspresję konstytutywnie aktywnego Smo, a tym samym aktywność szlaku Shh. Wszystkie komórki ustanowionych linii komórkowych medulloblastoma wykazywały ekspresję YFP, a większość z nich współwyrażała wysokie poziomy różnych markerów komórek macierzystych układu nerwowego, takich jak Nestin i Sox2. Co ciekawe, podczas detekcji sygnału YFP przy minimalnej mocy lasera podczas mikroskopii konfokalnej, wykryto skoncentrowany sygnał YFP w rzęskach komórek Sox2+. Obserwacja ta jest zgodna z niedawnym raportem 12, w którym opisano kluczową rolę rzęsek w rozwoju medulloblastoma zależnego od szlaku Shh.
<img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig4.jpg" alt="Różnicowanie komórek w ciągu 10 dni; obrazy mikroskopowe śledzące zmiany morfologiczne, analiza badawcza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Ustanowione komórki nowotworowe ulegają ekspansji klonalnej. Po dysocjacji do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, komórki nowotworowe wysiano na płytkę 24-dołkową z gęstością klonalną 300 komórek na mL pożywki hodowlanej. W każdym dołku zaobserwowano kolonie podlegające ekspansji klonalnej. Ta seria obrazów w jasnym polu demonstruje typowe zmiany w ciągu 10-dniowego okresu hodowli.
<img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig5.jpg" alt="Mikroskopia różnicowania komórek; immunofluorescencja; ekspresja białka YFP; markery neurogenezy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
 Rycina 5. Analizy różnicowania ustalonych linii komórkowych medulloblastoma. Po przeniesieniu komórek nowotworowych z medium bezsurowiczego zawierającego EGF/bFGF do DMEM/10% FBS, komórki nowotworowe YFP+ uległy znacznemu przekształceniu morfologicznemu i zróżnicowały się w różne typy komórek, w tym neurony Tuj1+ lub NeuN+, komórki astroglialne GFAP+ lub oligodendrocyty CNPase+.

<ol><li>Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma%3A+From+Molecular+Pathology+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy.</a> Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Neuronal+Precursor+Proliferation+in+the+Cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje-cell-derived+Sonic+hedgehog+regulates+granule+neuron+precursor+cell+proliferation+in+the+developing+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum.</a> Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Fan, X., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medullablastoma+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Medullablastoma Stem Cells.</a> J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).</li>
<li>Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+Role+for+Hedgehog+Pathway+Activation+in+Desmoplastic+Medulloblastoma+by+Identifying+GLI1+Target+Genes.+International+journal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer.</a> 124 (1), 109-109 (2009).</li>
<li>O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+anatomic+and+molecularly+targeted+imaging+in+the+diagnosis+and+surveillance+of+embryonal+tumors+of+the+nervous+and+endocrine+systems+in+children.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+metastasis+reviews%22%5BJournal%5D)">Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review.</a> Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).</li>
<li>Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+Growth+Factor+2+Is+Required+for+Progression+to+Advanced+Medulloblastoma+in+patched1+Heterozygous+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice.</a> Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).</li>
<li>Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origins+of+Medulloblastoma+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Origins of Medulloblastoma Subtypes.</a> Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).</li>
<li>Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+CD15%2B+Cancer+Stem+Cells+in+Patched-1+Deficient+Mouse+Medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma.</a> Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).</li>
<li>Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Somatic+Mouse+Model+to+Survey+Tumorigenic+Potential+Applied+to+the+Hedgehog+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway.</a> Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).</li>
<li>Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy wydajną metodę izolacji, wzbogacania i hodowli komórek macierzystych medulloblastoma z tkanki pierwotnego guza pobranej od myszy mutantów z konstytutywnie aktywnym szlakiem sygnałowym Hedgehog. Stwierdziliśmy, że kluczowym krokiem w skutecznym ustanowieniu zdrowej linii komórek macierzystych guza jest zastosowanie Accutase podczas dysocjacji tkanki pierwotnego guza. W naszym doświadczeniu, przy pierwszej dysocjacji tkanki guza z móżdżku, 4 minuty inkubacji w 50% Accutase w 37°C, a następnie 3 minuty powtarzalne...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50%</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td> 0.1%</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2mM</td></tr><tr><td>Szalki Primaria</td><td>Fisher Scientific</td><td>087724C</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw Sox2</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4343</td><td>Mysie, 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw Nestin</td><td>DSHB</td><td>rat401</td><td>Mysie, 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw YFP</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A11122</td><td>Królicze, 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw GFAP</td><td>Neuromics</td><td>CH22102</td><td>Kurze, 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw Tuj1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5076</td><td>Mysie, 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw NeuN</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Mysie, 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw CNPase</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB326</td><td>Mysie, 1:1000</td></tr></tbody></table>

izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastomy

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Sugeruje się, że guzy mózgu posiadają niewielką populację komórek macierzystych, które stanowią pierwotną przyczynę tumorigenazy. W celu badania natury neuralnych komórek macierzystych, w tym tych pochodzących z tkanek prawidłowych i nowotworowych, powszechnie stosuje się testy neurosferyczne. Jednak w hodowlach neurosfer często dochodzi do znacznej dyferencjacji i obumierania komórek, co prawdopodobnie wynika z nieoptymalnych warunków, takich jak ograniczony dostęp wszystkich komórek wewnątrz agregatów sferycznych do pożywki hodowlanej.
Medulloblastoma, najczęstszy nowotwór OUN u dzieci, charakteryzuje się szybką progresją oraz tendencją do rozprzestrzeniania się wzdłuż całej osi mózgowo-rdzeniowej, co wiąże się z niepomyślnymi rokowaniami klinicznymi. Medulloblastoma jest nowotworem neuroepithelialnym móżdżku, stanowiącym odpowiednio 20% wewnątrzczaszkowych oraz 40% nowotworów dołu tylnego u dzieci1. Obecnie wiadomo, że sygnalizacja Shh stymuluje proliferację prekursorów neuronów ziarnistych móżdżku (CGNPs) podczas rozwoju móżdżku 2-4. Liczne badania z wykorzystaniem modeli mysich, w których ścieżka Shh jest konstytutywnie aktywowana, powiązały sygnalizację Shh z medulloblastomą 5-9.
Niedawny raport wykazał, że podgrupa komórek medulloblastoma pochodzących z myszy Patched1LacZ/+ to komórki macierzyste nowotworu, które są zdolne do inicjowania i propagowania guzów 10. W niniejszej pracy opisujemy wydajną metodę izolacji, wzbogacania i utrzymania komórek macierzystych nowotworu pochodzących z kilku mysich modeli medulloblastoma z konstytutywnie aktywnym szlakiem Shh z powodu mutacji w białku Smoothened (11, dalej określanym jako SmoM2), będącym receptorem GPCR kluczowym dla aktywacji szlaku Shh. Z każdej izolowanej tkanki medulloblastoma udało nam się utworzyć liczne, silnie proliferujące kolonie. Komórki te wykazywały silną ekspresję kilku markerów neuronalnych komórek macierzystych, takich jak Nestin i Sox2, mogą podlegać seryjnym pasażom (powyżej 20) i wykazywały zdolność do tworzenia kolonii. Choć hodowane w warunkach sprzyjających wzrostowi komórek macierzystych komórki macierzyste nowotworu były stosunkowo małe, często bipolarne i z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy, po zmianie na podłoże hodowlane uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej dramatycznie zmieniły swoją morfologię: rozwinęły liczne wypustki komórkowe, spłaszczyły się i wyszły z cyklu komórkowego. Co ważniejsze, komórki macierzyste nowotworu te zróżnicowały się w neurony Tuj1+ lub NeuN+, astrocyty GFAP+ oraz oligodendrocyty CNPase+, co podkreśla ich wielopotencjalność. Ponadto komórki te były zdolne do propagowania wtórnych medulloblastom po ortotopowym przeszczepieniu do myszy biorców.

Niniejszy protokół opisuje izolację, wzbogacanie i utrzymanie komórek macierzystych nowotworu medulloblastoma pochodzących od mutantowych myszy z ektopową aktywnością szlaku Sonic hedgehog.

Izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastomy

Sugeruje się, że guzy mózgu posiadają niewielką populację komórek macierzystych, które stanowią pierwotną przyczynę tumorigennezy. Testy neurosferyczne zostały...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek medulloblastomy myszy o właściwościach komórek macierzystych. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie tkanki medulloblastomy od genetycznie zmodyfikowanej myszy. Drugim krokiem procedury jest mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja wyciętej tkanki nowotworowej.Trzecim krokiem procedury jest wirowanie zdysocjowanych komórek nowotworowych, a następnie usunięcie roztworu enzymatycznego. Ostatnim etapem procedury jest wysianie komórek nowotworowych do żelatynowanych naczyń hodowlanych. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące tworzenie wysoce proliferacyjnych, klonogennych i multipotencjalnych komórek macierzystych medulloblastoma, które mogą przechodzić wielokrotne pasażowanie i propagować guzy wtórne w testach allogenicznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda hodowli neurosfer dla nowotworowych komórek macierzystych, jest fakt, że pozwala ona na równomierny dostęp do składników odżywczych, co zmniejsza różnicowanie spontaniczne. W procesie apoptozy blastomy w modelu My sparing często stają się wodogłowie i wykazują typowe objawy neurologiczne, w tym

isolation-enrichment-and-maintenance-of-medulloblastoma-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja, wzbogacanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastoma

Niniejszy protokół opisuje izolację i dysocjację tkanki medulloblastoma myszy oraz późniejsze alloprzeszczepienie komórek nowotworowych do myszy biorców z niedoborem odporności w celu zainicjowania wtórnego medulloblastoma.

Wewnątrzczaszkowe ortotopowe przeszczepianie allogeniczne komórek medulloblastoma u myszy z niedoborem odporności

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę...

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Protokół rozmnażania zdysocjowanych próbek chirurgicznych glejaka wysokiego stopnia w pożywce neurosfery wolnej od surowicy do selekcji komórek o fenotypie rakowych komórek macierzystych. W przypadku próbek, które nie rosną jako neurosfery, sugerowany jest alternatywny protokół. Opisano technikę zatapiania parafiny w celu utrzymania architektury neurosfery 3D dla immunocytochemii.

Optymalizacja hodowli komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości z próbek chirurgicznych do zastosowania w klinicznie istotnych modelach zwierzęcych i immunochemii 3D

Rakowe komórki macierzyste (CSC) są zaangażowane w nawroty nowotworu z powodu chemooporności. Zoptymalizowaliśmy protokół selekcji i namnażania CSC z linii komórkowych raka jajnika. Poprzez traktowanie komórek chemoterapeutykiem cisplatyną i hodowlę w pożywce promującej komórki macierzyste, wzbogacamy je o nieprzylegające hodowle CSC.

Wzbogacanie w chemooporne komórki macierzyste raka jajnika z ludzkich linii komórkowych

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Ten protokół umożliwia utrzymanie w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro poprzez naśladowanie mikrośrodowiska szpiku kostnego przy użyciu obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niższych stężeń cytokin i niedotlenienia.

Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Zawartość wodoronadtlenku lipidów stanowi najczęściej używany wskaźnik śmierci komórek ferroptotycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach po indukcji ferroptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Poznaj metodę izolacji i utrzymania komórek macierzystych rdzeniaka zarodkowego z mysich modeli genetycznych. Technika ta zapewnia lepszy dostęp do składników odżywczych, zmniejszając spontaniczną różnicowanie i śmierć komórek w porównaniu do klasycznych metod neurosferowych.

Izolacja, namnażanie i utrzymanie komórek macierzystych medulloblastomy

Przeglądaj więcej filmów