Name: Test do pomiaru aktywności indukowanej przez Escherichia coli dekarboksynozy lizyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności dekarboksylazy lizyny E. coli za pomocą testu kolorymetrycznego z wykorzystaniem substratu L-lizyny i ekstrakcji toluenowej. Ta technika umożliwia badanie kinetyki enzymatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Michaelowi Cashelowi (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) za przesłanie szczepów bakteryjnych, plazmidów oraz niezbędnych protokołów. Dziękujemy dr. Johnowi Gloverowi (Department of Biochemistry, University of Toronto) za możliwość skorzystania z czytnika płytek SpectraMax. UK jest laureatem stypendium dla doktorantów National Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), uczestnikiem programu Canadian Institutes of Health Research Strategic Training Program in the Structural Biology of Membrane Proteins Linked to Disease oraz stypendystą University of Toronto Open Fellowship. Praca ta była wspierana grantem z Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) przyznanym WAH.

1) Odczynniki i sprzęt
<ol>
 <li>W pierwszej kolejności przygotować następujące trzy roztwory: 1 mL roztworu A, składającego się z 8 mM L-lizyny, 100 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) sodowego o pH 6,5, 0,2 mM nukleotydu, gdzie nukleotydem jest: guanozynodifosforan (GDP), guanozynotrifosforan (GTP), guanozyno 5'-difosforan, 3'-difosforan (ppGpp) lub guanozyno 5'-trifosforan, 3'-difosforan (pppGpp), 0,1 mM 5'-fosforanu pirydoksalu (PLP) oraz 1 mM β-merkaptoetanolu (β-ME). 1 mL roztworu B, składającego się ze 100 mM MES sodowego o pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME oraz 50 nM LdcI. LdcI oczyszczono zgodnie z opisem w pracy Snider et al.6 oraz Kanjee et al. 14. 
 1 mL roztworu C, który jest identyczny z roztworem B, ale nie zawiera LdcI.</li>
 <li>Przygotować 100 mL roztworu zatrzymującego, składającego się z 1 M węglanu sodu (10,6 g/100 mL), i odmierzyć 50 μL do każdej studzienki polistyrenowej płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać do płytki 30 μL wody, a następnie ją przykryć. Należy pamiętać, że suma objętości dodanej wody i objętości próbki pobranej podczas reakcji enzymatycznej musi wynosić 50 μL. W tym przypadku pobrane zostanie 20 μL próbki z reakcji enzymatycznej.</li>
 <li>Przygotować 5 mL roztworu TNBS o stężeniu 10 mM poprzez rozcieńczenie 294 μL roztworu stokowego TNBS 5% (m/v) z 4706 μL wody; zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w lodzie.</li>
 <li>Ustalić temperaturę w urządzeniu Eppendorf ThermoStat Plus na 37°C. ThermoStat Plus posiada 24 gniazda w 6 kolumnach. Patrz Rysunek 2 w celu zapoznania się ze schematem. Oznaczyć probówki Eppendorf 1,5 mL, wskazując rodzaj testowanego nukleotydu (jedna na kolumnę): GTP (kolumna A), GDP (kolumna B), ppGpp (kolumna C), pppGpp (kolumna D), brak nukleotydu (kolumna E) oraz próbki białek (kolumna F).</li>
 <li>Ułożyć kilka pudełek z końcówkami 200 μL w taki sposób, aby pominąć co drugi rząd, co da łącznie cztery rzędy końcówek. Jest to konieczne do użycia pipety wielokanałowej z blokiem grzejnym ThermoStat Plus podczas analizy enzymatycznej.</li>
 <li>Ustalić temperaturę w cyfrowym bloku grzejnym (VWR) na 42°C.</li>
 <li>Umieścić 96-dołkową polipropylenową płytkę o pojemności 2,0 mL w lodzie w celu schłodzenia.</li>
</ol>
2) Analiza LdcI
<ol>
 <li>Do probówek Eppendorf 1,5 mL w każdej z pięciu kolumn termobloku Eppendorf ThermoStat odmierzyć 50 μL Roztworu A z odpowiednim nukleotydem.</li>
 <li>Do trzech probówek w kolumnie F dodać 330 μL Roztworu B, a do ostatniej probówki w kolumnie F dodać 330 μL Roztworu C (kontroli bezbiałkowej).</li>
 <li>Równoważyć roztwory w temperaturze 37°C przez pięć minut. Wskazówka: po 5 minutach usunąć zakrętki probówek znajdujących się w centrum bloku grzejnego, aby nie przeszkadzały one przy późniejszym użyciu pipety wielokanałowej.</li>
 <li>Za pomocą wielokanałowej pipety VWR o zakresie 5-50 μL przenieść 50 μL z probówek w kolumnie F do każdej z probówek w kolumnach A-E. Uruchomić stoper natychmiast po wymieszaniu pierwszej probówki.</li>
 <li>W 2, 4 i 6 minucie pobrać 20 μL próbki za pomocą pipety wielokanałowej i dodać do roztworu zatrzymującego.</li>
 <li>Uwaga: próbki w roztworze zatrzymującym można przykryć folią spożywczą i zamrozić w temperaturze -20°C do późniejszej analizy. Płytki należy rozmrozić w temperaturze pokojowej przed przeprowadzeniem reakcji z TNBS.</li>
</ol>
3) Reakcja z TNBS i rozwój barwy
<ol>
 <li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μL 10 mM roztworu TNBS do roztworu zatrzymującego, a następnie inkubuj w temperaturze 42°C przez 6 minut. Roztwór przybierze ciemnożółty lub pomarańczowy kolor w wyniku reakcji TNBS z lizyną i kadaweryną.</li>
 <li>Po 6 minutach schłodź płytkę na lodzie, aby spowolnić reakcję.</li>
 <li>Pobierz 100 μL próbki za pomocą wielokanałowej pipety VWR 20-200 μL i przenieś do schłodzonej na lodzie płytki z głębokimi dołkami o pojemności 2 mL. Przenieś pojemnik z lodem do dygestorium.</li>
 <li>Do każdego dołka dodaj 500 μL toluenu, używając powtarzalnej pipety HandyStep (Brand) i końcówki do pipety 12,5 mL (Plastibrand).</li>
 <li>Zetrzyj nadmiar toluenu za pomocą chusteczki Kimwipe i zakryj płytkę paskami taśmy pakowej. Należy mocno docisnąć taśmę, aby zapewnić szczelność. Przykryj płytkę 96-dołkową płaską pokrywką, a następnie energicznie wstrząsaj przez 1 minutę i 30 sekund.</li>
 <li>Pozostaw roztwory do oddzielenia faz przez 5 minut. TNP-kadaweryna znajduje się teraz w górnej fazie toluenowej, natomiast TNP-lizyna pozostaje rozpuszczalna w wodzie (patrz Rysunek 1).</li>
 <li>Pobierz 200 μL toluenu za pomocą wielokanałowej pipety 20-200 μL i przenieś do płytki 96-dołkowej przeznaczonej do odczytu. Uwaga: upewnij się, że pobierana próbka jest przejrzysta i nie zawiera dolnej fazy wodnej. Uwaga: używaj końcówek z filtrem (barrier tips), aby zapobiec uszkodzeniu pipety wielokanałowej przez toluen.</li>
 <li>Zmierz absorbancję przy 340 nm w czytniku płytek SpectraMax 340.</li>
 <li>Aby oczyścić płytkę kwarcową, wypłucz toluen wodą, a następnie umieść płytkę kwarcową w dużej szklanej kuwecie w dygestorium. Wlej 100 mL mieszaniny kwasu azotowego 70% (v/v) i etanolu 95% (v/v) w stosunku 7:3 i przykryj płytkę kwarcową drugą szklaną kuwetą. Ostrzeżenie: reakcja jest silnie egzotermiczna i czasami może doprowadzić do wybuchu; należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i upewnić się, że przesłona dygestorium jest ustawiona na poziomie 6" od dołu. Po ochłodzeniu wypłucz kwas azotowy wodą, a następnie etanolem 95%.</li>
</ol>
4) Reprezentatywne wyniki
1) Krzywa standardowa kadaweryny (Rysunek 3) 
 Analizę przeprowadzono zgodnie z opisem, lecz bez dodatku L-lizyny lub LdcI; w zamian zastosowano różne stężenia kadaweryny, aby empirycznie określić zakres liniowy analizy. Analiza wykazała liniowość do wartości OD340 wynoszącej 0,25, co odpowiada ok. 22 nmol kadaweryny (Rysunek 3).
2) Aktywność LdcI (Rysunek 4) 
 Ustalono, że aktywność samego LdcI wynosiła 153,5 (± 18,1) nmoles kadaveryny min-1 μg LdcI-1 przy pH 6,5. Aktywność LdcI nie zmienia się w obecności 100 μM GTP lub GDP, lecz jest silnie hamowana (&gt;10-krotnie) w obecności pppGpp i ppGpp (Rysunek 4).
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig1.jpg" alt="Schemat reakcji chemicznej: L-lizyna i TNBS z enzymem LdcI w celu syntezy pochodnych TNP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat reakcji LdcI. Przedstawiono reakcję dekarboksylacji L-lizyny prowadzącą do powstania CO2 i kadaweryny, a także następującą reakcję z TNBS przy wysokim pH, w wyniku której powstaje N,N'-bis(2,4-dinitrofenylo)kadaweryna (TNP-kadaweryna) oraz N,N'-bis(2,4-dinitrofenylo)lizyna (TNP-lizyna). Na podstawie Phan et al.11
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig2.jpg" alt="Schemat inkubacji na mikropłytce i procesu analizy z użyciem płytek 96-dołkowych dla rozwoju reakcji TNBS." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Konfiguracja termostatu Eppendorf. Przedstawiono rozmieszczenie próbek w 24-dołkowym termostacie Eppendorf ThermoStat wraz z opisem etapów analizy (oznaczonych pogrubioną czcionką). Strzałki wskazują przenoszenie roztworów reakcyjnych zgodnie z protokołem. Wskazano również przeniesienie roztworu reakcyjnego do roztworu zatrzymującego na płytce 96-dołkowej.
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig3.jpg" alt="Analiza chromatograficzna, wykres przedstawiający zależność absorbancji od nmoli kadaweryny, trend liniowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Krzywa wzorcowa dla kadaweryny. Przedstawiono wykres zależności absorbancji przy 340 nm od liczby nmoli kadaweryny. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z co najmniej trzech niezależnych pomiarów. Przedstawiono również linię trendu z współczynnikiem R2 wynoszącym 0,996.
<img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy tempa produkcji kadaweryny dla stężeń GTP, GDP, ppGpp, pppGpp oraz bez nukleotydów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Wyniki analizy LdcI. Przedstawiono wykres szybkości aktywności LdcI (w nmoles produkowanej kadaweryny min-1 μg-1 LdcI) w obecności 100 μM GTP, GDP, pppGpp, ppGpp oraz wykluczając obecność nukleotydów. Nukleotydy odpowiedzi rygorystycznej (p)ppGpp są zdolne do znaczącego hamowania aktywności LdcI. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z co najmniej sześciu niezależnych pomiarów.

<ol><li>Gale, E. F., Epps, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+pH+of+the+medium+during+growth+on+the+enzymic+activities+of+bacteria+%28Escherichia+coli+and+Micrococcus+lysodeikticus%29+and+the+biological+significance+of+the+changes+produced%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced.</a> Biochem J. 36, 600-618 (1942).</li>
<li>Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+acid+resistance%3A+tales+of+an+amateur+acidophile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).</li>
<li>Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Control of acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).</li>
<li>Iyer, R., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine-agmatine+antiporter+in+extreme+acid+resistance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).</li>
<li>Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+physical+properties+of+inducible+Escherichia+coli+lysine+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase.</a> Biochemistry. 13, 662-670 (1974).</li>
<li>Snider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+distinctive+complex+between+the+inducible+bacterial+lysine+decarboxylase+and+a+novel+AAA%2B+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase.</a> J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).</li>
<li>Kashiwagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+the+genes+for+putrescine+transport+protein+and+ornithine+decarboxylase+at+16+min+on+Escherichia+coli+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome.</a> J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).</li>
<li>Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manifold+of+vitamin+B6+dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The manifold of vitamin B6 dependent enzymes.</a> Structure. 8, 1-6 (2000).</li>
<li>Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella+%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology</a>. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp%3A+a+global+regulator+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).</li>
<li>Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+assay+for+lysine+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase.</a> Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).</li>
<li>Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+pH+crisis%2C+lysine+decarboxylase+and+the+acid+tolerance+response+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium.</a> Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).</li>
<li>Merrell, D. S., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cadA+gene+of+Vibrio+cholerae+is+induced+during+infection+and+plays+a+role+in+acid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance.</a> Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).</li>
<li>Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+Bacterial+Acid+Stress+and+Stringent+Responses+Revealed+by+the+Structure+of+the+Inducible+Lysine+Decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase.</a> EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W teście aktywności lizynodekarboksylazy TNBS reaguje z aminami pierwszorzędowymi L-lizyny i kadaweryny, tworząc addukty TNP-lizyny i TNP-kadaweryny (Rysunek 1). Ze względu na obecność grupy kwasu karboksylowego w TNP-lizynie, addukt ten pozostaje rozpuszczalny w wodzie, podczas gdy TNP-kadaweryna, pozbawiona grupy kwasu karboksylowego, może przenikać do toluenu11. Ten rodzaj analizy może być stosowany szerzej w przypadku innych aminokwasów, w których podczas reakcji dochodzi do utraty grupy kwasu karboksylowe...

<table><tbody><tr><td>kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mM 5&amp;rsquo;-fosforan pyridoksalu (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9255</td><td></td></tr><tr><td>Kadaweryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D22606</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowe płytki 96-dołkowe</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwarcowa płytka 96-dołkowa</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy blok grzejny VWR Digital Heatblock</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoStat Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polipropylenowe płytki 96-dołkowe 2.0 mL</td><td>Axygen Scientific</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>dozownik wielokrotny Handy Step Repeat Pipettor</td><td>Brand GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówki do dozownika wielokrotnego 12.5 mL</td><td>Brand GmbH</td><td>702378</td><td></td></tr><tr><td>czytnik płytek SpectraMax 340PC</td><td>SpectraMax</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli to bakteria jelitowa zdolna do wzrostu w szerokim zakresie wartości pH (pH 5 - 9)1 i, co niezwykłe, potrafi przetrwać ekstremalny stres kwasowy, w tym przejście przez żołądek ssaków, gdzie pH może spaść nawet do pH 1 - 22. Aby umożliwić przeżycie w tak szerokim zakresie niskiego pH, E. coli posiada cztery różne indukowalne dekarboksylazy aminokwasów, które dekarboksylują swoje substraty aminokwasowe w sposób zależny od protonów, podnosząc tym samym wewnętrzne pH. Dekarboksylazy te obejmują dekarboksylazy kwasu glutaminowego GadA i GadB3, dekarboksylazę argininy AdiA4, dekarboksylazę lizyny LdcI5, 6 oraz dekarboksylazę ornityny SpeF7. Wszystkie te enzymy wykorzystują fosforan pyridoksalu-5' jako kofaktor8 i funkcjonują wspólnie z antyporterami substrat-produkt zlokalizowanymi w błonie wewnętrznej, które usuwają produkty dekarboksylacji do środowiska zewnętrznego w zamian za nowy substrat2. W przypadku LdcI antyporter lizyna-kadaweryna nazywa się CadB. Niedawno określiliśmy strukturę krystaliczną LdcI metodą rentgenograficzną z rozdzielczością 2,0 Å i odkryliśmy nową małą cząsteczkę związaną z LdcI — regulator odpowiedzi rygorystycznej guanozyno-5'-difosforan-3'-difosforan (ppGpp)14. Odpowiedź rygorystyczna występuje, gdy komórki w fazie wzrostu wykładniczego doświadczają niedoboru składników odżywczych lub jednego z wielu innych stresów9. W rezultacie komórki produkują ppGpp, co prowadzi do kaskady sygnałowej kończącej się przejściem z fazy wzrostu wykładniczego do fazy stacjonarnej10. Wykazaliśmy, że ppGpp jest specyficznym inhibitorem LdcI14. Opisujemy tutaj test dekarboksylazy lizyny, zmodyfikowany na podstawie metody opracowanej przez Phana i współpracowników11, który wykorzystaliśmy do oznaczenia aktywności LdcI oraz wpływu pppGpp/ppGpp na tę aktywność. Reakcja dekarboksylacji LdcI usuwa grupę α-karboksylową L-lizyny, wytwarzając dwutlenek węgla i poliaminę — kadawerynę (1,5-diaminopentan)5. L-lizyna i kadaweryna mogą reagować z kwasem 2,4,6-trinitrobenzensulfonowym (TNBS) przy wysokim pH, tworząc odpowiednio N,N'-bistrinitrofenylkadawerynę (TNP-kadaweryna) oraz N,N′-bistrinitrofenylolizynę (TNP-lizyna)11. TNP-kadawerynę można oddzielić od TNP-lizyny, ponieważ pierwsza z nich jest rozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak toluen, podczas gdy druga nie jest (patrz Rysunek 1). Zakres liniowy testu określono empirycznie przy użyciu oczyszczonej kadaweryny.

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Escherichia coli jest bakterią jelitową zdolną do wzrostu w szerokim zakresie wartości pH (pH 5–9)1 i, co niezwykłe, potrafi przetrwać ekstremalne...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar aktywności indukowalnejydekarboksylazy lizyny z E. coli przy użyciu testu KOLORYMETRYCZNEGO. Osiąga się to poprzez wstępną reakcję substratu L-lizyny z enzymem LDCI w probówce EOR, a następnie pobieranie próbek w trzech punktach czasowych do roztworu zatrzymującego. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie reakcji próbek w roztworze zatrzymującym z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym lub TNBS; TNBS reaguje z grupą pierwszorzędową substratu, tworząc odpowiednio produkty TMP-lizynę i TMP-kadawerę.Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie rozpuszczalnej w wodzie lizyny TMP od nierozpuszczalnego w wodzie kadaweryny TMP poprzez ekstrakcję kadaweryny TMP do toluenu. Ostatnim etapem procedury jest pomiar absorbancji kadaweryny TMP w fazie toluenowej przy długości fali 340 nanometrów. W ten sposób można uzyskać końcowe wyniki.Aktywność LDCI w komórkach CHO jest modulowana przez obecność cząsteczek sygnalizacyjnych odpowiedzi rygorystycznej: ppGpp oraz pppGpp. Dzień dobry, nazywam się Hir z laboratorium dr Waliego z Katedry Biochemii na Uniwersytecie w Toronto.Dzisiaj przedstawimy procedurę pomiaru aktywności indukowalnej lizynowejdeka

an-assay-for-measuring-activity-escherichia-coli-inducible-lysine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena pomiaru aktywności indukcyjnej lizyny dekarboksylazy Escherichia coli

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Zaprojektowano zrównoważony, samoregulujący się system bakteryjny do remediacji zanieczyszczeń ropą naftową, wykorzystując standardowe, wymienne części DNA (BioBricks). Zmodyfikowany szczep E. coli został wykorzystany do degradacji alkanów poprzez β-oksydację w toksycznych środowiskach wodnych. Odpowiednie enzymy pochodzące od różnych gatunków wykazały aktywność degradującą alkany. Ponadto, poprzez wprowadzenie genów z bakterii tolerujących alkany, osiągnięto zwiększoną tolerancję na n-heksan.

Zestaw narzędzi umożliwiających konwersję węglowodorów w środowiskach wodnych

Ten film demonstruje szybki test biologiczny do badania aktywności endotoksyn w próbce krwi pełnej za pomocą metody opartej na chemiluminescencji. Ten test jest szybkim i czułym testem biomarkerowym do wczesnej diagnozy sepsy zależnej od endotoksyn.

Test aktywności endotoksyn: test biologiczny oparty na chemiluminescencji do badania aktywności endotoksyn w próbce krwi

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Niniejszym przedstawiamy protokół do pomiaru przy łóżku pacjenta aktywności endotoksyn w próbkach ludzkiej krwi pełnej. Test aktywności endotoksyn jest prostym do wykonania testem i może być użytecznym biomarkerem u krytycznie chorych pacjentów z sepsą.

Test aktywności endotoksyn w celu wykrycia endotoksemii krwi pełnej u pacjentów w stanie krytycznym

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Badanie to ustanowiło metodę wykorzystującą rozszerzenie kodu genetycznego do skutecznej inkorporacji laktylizyny (Klac) w określonych miejscach ludzkiej enolazy-1 (hENO1) i superfolderu GFP (sfGFP) w komórkach Escherichia coli i ssaków.

Laktylacja lizyny specyficzna dla miejsca poprzez rozszerzenie kodu genetycznego w komórkach E. coli i ssaków

Przedstawiamy metodę wykorzystującą spektrometrię mas MALDI oraz chemię redukcyjnego metylowania do ilościowego określania zmian w metylowaniu lizyny.

Zastosowanie metody MassSQUIRM do ilościowych pomiarów aktywności demetylazy lizyny

Poznaj metodę pomiaru aktywności dekarboksylazy lizyny E. coli za pomocą testu kolorymetrycznego z wykorzystaniem substratu L-lizyny i ekstrakcji toluenowej. Ta technika umożliwia badanie kinetyki enzymatycznej.

Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów