Metoda izolacji mysich wysp trzustkowych i podtorebkowego przeszczepu nerki

Przeszczep oka został zaproponowany jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu pierwszego. Jednak dwa główne ograniczenia uniemożliwiają jej rozpowszechnienie w rzeczywistości klinicznej. Po pierwsze, potrzebna jest duża liczba oczek na odbiorcę.

Ze względu na to, że oczka pobiera się od dawców narządów, liczba potencjalnych biorców jest mocno ograniczona. Drugi przeszczep wymaga dożywotniego leczenia silnymi lekami immunosupresyjnymi, co naraża pacjenta, zwłaszcza populację pediatryczną, na ryzyko nowotworu złośliwego, infekcji i niewydolności nerek. Przeszczep oczka pod mysią torebką nerkową przeprowadza się w celu zbadania strategii poprawy wyników klinicznych przeszczepu.

Oczka wyizolowane od zdrowych myszy dawców podzielonych na grupy i przygotowanych do przeszczepu. Oczka są następnie przeszczepiane do przestrzeni podtorebkowej nerki. U myszy biorców z cukrzycą funkcję przeszczepu oczka ocenia się poprzez monitorowanie poziomu glukozy we krwi, które ujawnia, że około 250 do 350 oczek przywróci glikemię u u myszy biorcy o wadze 20 gramów w ciągu 24 godzin od przeszczepu.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie dla etapów kaniulacji. Wspólny przewód żółciowy i przenoszenie oczek do przestrzeni podtorebkowej nerki są trudne do nauczenia. Kroki te wymagają identyfikacji struktur tkankowych, stabilnych rąk i zastosowania techniki, która minimalizuje uszkodzenia tkanek.

Umieść uśpioną mysz w pozycji leżącej na plecach na ręczniku papierowym przy lunecie sekcyjnej i spryskaj brzuch 70% etanolem. Użyj nożyczek, aby otworzyć brzuch z nacięciem w kształcie litery V od okolicy łonowej do obu przednich nóg. Mysz znajduje się poniżej lunety sekcyjnej.

Ustaw go z głową skierowaną w stronę obserwatora. Zlokalizuj wejście dwunastnicy do wspólnego przewodu żółciowego za pomocą zacisku hemostatu, otworu dwunastnicy wspólnego przewodu żółciowego. Hemostat powinien być umieszczony w taki sposób, aby po ściśnięciu przebiegał dokładnie wzdłuż granicy jelita trzustkowego.

Tutaj zostaną zademonstrowane dwie metody kaniulacji przewodu żółciowego. Metoda wolnej ręki i metoda kleszczy wspomagają kaniulację przewodu żółciowego. Metodą wolnej ręki odciągnij hemostat zaciśnięty na dwunastnicy od głowy myszy w kierunku ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy stał się napięty.

W przewodzie żółciowym w pobliżu wątroby dochodzi do zbiegu, w którym łączy się żółć spływająca z pęcherzyka żółciowego i enzymy z wątroby Przed wejściem do jelit mocno pociągnij przewód żółciowy, aby odsłonić wnętrze pozycji V. Wygięta igła o rozmiarze 27 przymocowana do pięciomililitrowej strzykawki tak, aby igła przesuwała się przez literę V i bezpośrednio kaniulowała dolną część kanału. Wsuń igłę kilka milimetrów poza koniec skosu, aby zapobiec cofaniu się do wątroby i woreczka żółciowego.

Gdy kaniulacja się powiedzie, wykonaj perfuzję trzustki, dozując dwa mililitry liazy ze strzykawki. Zwróć uwagę na rozszerzenie trzustki nad żołądkiem jako wskaźnik optymalnej kaniulacji. Alternatywnie przewód żółciowy można kaniulować.

Za pomocą metody torbieli kleszczowej. Odciągnij hemostat C zaciśnięty na dwunastnicy od głowy myszy w kierunku ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy stał się kręty. Następnie za pomocą wygiętej igły o rozmiarze 27 przymocowanej do pięciomililitrowej strzykawki nakłuj powięź poniżej wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu wątroby.

Użyj igły, aby usunąć powięź z kanału, gdy igła jest nadal na miejscu. Odłóż hemostat i podnieś parę kleszczy. Użyj jednego ramienia otwartych kleszczy, aby podeprzeć przewód żółciowy, w którym igła oczyściła powięź, jednocześnie ciągnąc kanalik i kleszcze do przodu.

Wsuń igłę do kanału, używając kleszczy jako zabezpieczenia. O udanej kaniulacji świadczy równomierne rozszerzenie obszaru trzustki na szczycie żołądka. Po perfuzji trzustki usuń hemostat z dwunastnicy.

Następnie użyj kleszczy, aby podnieść dwunastnicę i użyj drugiej pary kleszczy, aby oddzielić trzustkę od jelit. Następnie wyciągnij trzustkę z górnej części żołądka i śledziony. Na koniec wyjmij trzustkę z brzucha i odetnij ją od pozostałych połączeń powięziowych z jelitem, żołądkiem i śledzioną.

Umieść trzustkę w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i umieść ją na lodzie. Inkubować trzustkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym pisemnym protokole. Po inkubacji dodaj 20 mililitrów pożywki do probówek i oddziel tkankę, energicznie potrząsając probówkami 40 razy w ciągu 10 sekund.

Ten krok ma kluczowe znaczenie dla optymalnego odzyskiwania fiołków. Komórki wirujące wykonują 800 obrotów na minutę. Resus wydaje się w 15 mililitrach pożywki i kondensuje próbki.

Przelej zawieszoną zawiesinę przez siatkę drucianą o grubości 0,419 milimetra i przelej ją do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz pierwszą probówkę dodatkowymi 10 mililitrami pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i przelej ją przez osad z siatki drucianej, komórki przez odwirowanie reus, zgnij osad w pięciu mililitrach temperatury pokojowej jego nieprzezroczystej 10 77. Następnie delikatnie wiruj przez kilka sekund, dodaj dodatkowe pięć mililitrów jego nieprzezroczystego wokół wnętrza tuby, aby powoli zmyć oczka ze ścianki probówki, pipetować, aby nałożyć 10 mililitrów wolnego RPMI surowicy na bok probówki w tempie jednego mililitra na 10 sekund.

Ostry interfejs powinien być widoczny. Następnie obracać próbki w wirówce z odchylanym wiadrem w temperaturze 20 stopni Celsjusza i 900-krotności grawitacji przez 20 minut z bardzo wolnym przyspieszeniem i bez hamowania po odwirowaniu, wysepki zostaną oddzielone od komórek zewnątrzwydzielniczych za pomocą jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów. Przenieś oczka z interfejsu mediów histo Paque do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

W tym momencie można połączyć kilka probówek, aby usunąć resztki oczek, jego nieprzezroczyste probówki napełniają surowicą zawierającą pożywkę i osadzają wysepki, wirując probówki przez dwie minuty z prędkością 800 obrotów na minutę. Następnie ponownie zawiesić wysepki na świeżym podłożu. Powtórz ten krok co najmniej dwa razy. Reus.

Zawieś paletę w pięciu mililitrach nośnika. Umieść sitko z nylonu o średnicy 0.1 milimetra do góry nogami na stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Odpipetować zawiesinę zawieszonych komórek w celu zebrania oczek.

Następnie przepłucz 50-mililitrową probówkę dodatkowymi sześcioma mililitrami pożywki i przepuść ją przez sitko. Umieść trzymililitrową kroplę pożywki na 10-centymetrowej szalce Petriego. Odwróć sitko komórkowe i zanurz je w kropli pożywki, aby zebrać oczka, odpipetować dodatkowe pięć do siedmiu mililitrów pożywki hodowlanej przez sitko do szalki Petriego.

Aby zebrać pozostałe oczka z sitka pod czterokrotnym obiektywem, wybierz oczka pojedynczo pipetą P 200 i przenieś je do 1,5-mililitrowej mikrorurki fuge. Zdjęcia te pokazują oczka wyizolowane od 12-tygodniowych czarnych sześciu myszy C 57. Czystość i jakość oczek można ocenić pod mikroskopem po zakończeniu procedury izolacji.

Na przykład dwa pokazane tutaj obrazy pokazują reprezentatywne pole, w którym obecne są szczątki i zanieczyszczenie komórkami zewnątrzwydzielniczymi. Wybierając oczka do eksperymentu, unikaj wybierania zanieczyszczających komórek zewnątrzwydzielniczych lub oczek, które wydają się niezdrowe. Oczka z centrami martwiczymi są niezdrowe, jak pokazano na tym rysunku wykonanym 24 godziny po izolacji, ogniska martwicze nie będą widoczne natychmiast po izolacji.

Oczka, które są złuszczonymi komórkami, są nieuniknione i mogą być używane do przeszczepu oczek w tym 24-godzinnym filmie poklatkowym z oczkami. Bezpośrednio po izolacji w wielu oczkach rozwijają się ośrodki martwicze. Te nekrotyczne centra wydają się być wyrzucane z oczka pod koniec nagrania podczas wybierania oczek.

Pogrupuj je tak, aby każda tubka miała równomierny rozkład jakości i wielkości oczek. Na przykład każda grupa 15 oczek może zawierać cztery oczka o dużych rozmiarach, sześć średnich oczek i pięć małych oczek. Miejsce. Rurka na oczkach do lodu może być natychmiast użyta do przeszczepu lub manipulowana.

Przed użyciem. Umieść sterylną końcówkę ładującą żel w otworze 1,5-mililitrowej mikrorurki z topionym płynem, tak aby nastąpiło delikatne zagięcie, które tworzy kształt litery U na wąskim końcu końcówki. Oba otwory końcówki powinny być skierowane bezpośrednio do góry na zewnątrz rurki z mikrośmieciami.

Delikatnie wyjmij tubkę oczek z lodu. Upewnij się, że wszystkie oczka osiadły na dnie tuby. Za pomocą pipety P 200 delikatnie zebrać oczka w minimalnej objętości od dna probówki i przenieść je na przygotowaną zakrzywioną końcówkę.

Po osadzeniu się oczek usuń jak najwięcej pożywki z końcówki, zasysając pożywkę przez duży otwór końcówki do ładowania żelu z oczkiem Za pomocą świeżej końcówki ładującej żel dołączonej do pipety P 200. Przymocuj nieskośny koniec rurki do wąskiego otworu końcówki ładującej żel z łożyskiem wysepki. Następnie przymocuj końcówkę do pipety P 200 i delikatnie wepchnij wysepki do rurki.

Następnie podłącz nieskośną krawędź rurki PE 50 do igły 25-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona. Po wycofaniu tłoka należy nacisnąć tłok strzykawki do momentu, gdy oczka znajdą się w odległości około 0,5 centymetra od skośnego otworu. Odłożyć strzykawkę na bok tak, aby oczka mogły osiąść w jedną masę w pobliżu skośnego otworu rurki, podczas gdy nerka jest przygotowywana do przyjęcia oczek.

Przygotuj miejsce operacji, obcinając włosy i szorując skórę Betadine na przemian z 70% alkoholem izopropylowym trzy razy. Procedurę przeszczepu oka należy rozpocząć od uszczypnięcia palca u nogi w celu potwierdzenia znieczulenia u myszy biorcy. Umieść trzon szklanego pręta bezpośrednio pod myszą i poniżej nerki prostopadle do rdzenia kręgowego.

Następnie zlokalizuj nerkę przez skórę i umieść sterylną obłożę chirurgiczną. Po zlokalizowaniu nerki użyj nożyczek banis McFerson, aby wykonać dwucentymetrowe nacięcie w skórze właściwej bezpośrednio nad nią, prostopadle do rdzenia kręgowego. To nacięcie odsłoni ścianę otrzewnej nożyczkami.

Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie przez ścianę otrzewnej w tym samym kierunku, w którym przecięto warstwę skórną, używając trzonu szklanego pręta jako zabezpieczenia, wepchnij nerkę przez otwór otrzewnej, naciskając na sąsiednią powierzchnię. Zwilż powierzchnię odsłoniętej nerki lodowatym, sterylnym PBS za pomocą nasączonego bawełnianej końcówki aplikatora. W razie potrzeby powtarzaj ten krok co kilka minut, aby zapobiec wysychaniu torebki nerkowej.

Za pomocą igły o rozmiarze 27 wykonaj 0,2-centymetrowe nacięcie przez torebkę nerkową w poprzek przedniej powierzchni nerki. Poruszając się od lewej strony bocznej w kierunku prawej strony bocznej, włóż szklaną rurkę kapilarną ciągniętą płomieniem. Sonduj przez wykonane wcześniej nacięcie i przesuń je w kierunku tylnym wzdłuż grzbietowej bocznej powierzchni nerki.

Aby utworzyć woreczek między torebką nerkową a miąższem nerki, należy przesunąć oczka w przygotowanej 25-mililitrowej strzykawce Hamiltona do samej krawędzi skośnego otworu elastycznej rurki. Następnie włóż ściętą krawędź skierowaną do góry do torebki podtorebkowej. Długa krawędź styka się z miąższem nerki.

Przesunąć rurkę do najbardziej wysuniętego do tyłu końca kapsułki. Następnie powoli przenieść oczka z rurki PE 50 do torebki podkapsułkowej, naciskając tłok strzykawki. Gdy oczka wypełniają woreczek, powoli wysuń elastyczną rurkę, aby zrobić więcej miejsca.

Po wyjęciu rurki z torebki przesuń szklaną sondę wzdłuż zewnętrznej powierzchni nerki od przodu do tyłu, aby delikatnie umieścić oczka w bliższym końcu torebki. Za pomocą zgiętych kleszczyków do ramion podnieś błonę śluzową otrzewnej przylegającą do otworu wykonanego dla nerki. Następnie użyj aplikatora nasączonego bawełnianą końcówką PBS, aby delikatnie wepchnąć nerkę z powrotem do jamy otrzewnej.

Zamknij mysz, zakładając szwy na ścianę otrzewnej i klipsy do rany na warstwę skórną. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitorze. W celu rekonwalescencji należy zapewnić wodę aceto meine dla jelit myszy.

C oczka myszy na białym tle. Korzystając z metod opisanych w tym filmie i dawki leczniczej, przeszczepiono allogenicznym C 57 czarnym sześciu myszom. Poziom glukozy we krwi na czczo był monitorowany począwszy od pierwszej dobie po operacji.

Odrzucenie można zaobserwować około 17 dnia u myszy biorcy o wadze 20 gramów, które otrzymały 300 oczek od dawcy allogenicznego. Rekonwalescencja była monitorowana u myszy, które otrzymały 150 lub 300 oczek od dawców syngenicznych. W tych przeszczepach nie obserwuje się odrzucenia, ponieważ oczka pochodzą od dawców syngenicznych.

Podana dawka oczek mierzy pierwotną funkcję oczek bezpośrednio po przeszczepie. Podczas gdy marginalną regenerację zaobserwowano po 150 oczkach, pełne wyzdrowienie zaobserwowano po przeszczepieniu 300 oczek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać krytyczne kroki wymagane do wyizolowania oczek myszy i przeszczepienia tych oczek pod przestrzeń podtorebkową nerki.

Wraz z praktyką rozwiniesz zdolność do szybkiej kaniulacji wspólnego przewodu żółciowego, co jest najtrudniejszym krokiem tego protokołu.