Name: Metoda izolacji mysich wysp trzustkowych i podtorebkowego przeszczepu nerki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji wysp trzustkowych myszy i ich przeszczepu pod torebkę nerki. Technika ta umożliwia badanie strategii poprawy wyników klinicznych transplantacji w leczeniu cukrzycy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca jest wspierana przez grant RO1 DK064938 (przyznany T.H.).

<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Optom+Assoc%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li>
<li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes%3A+the+UIC+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li>
<li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+ATF3%2C+an+adaptive-response+gene%2C+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li>
<li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li>
<li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cyclosporin-A%2C+low-temperature+culture%2C+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
<li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li>
<li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li>
<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
<li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W powyższych sekcjach opisaliśmy szczegółowe etapy izolacji i transplantacji wysepek trzustkowych myszy. Poniżej krótko przedstawiamy kroki, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tych procedur.
1. Izolacja wysepek
Kluczowe etapy obejmują określenie optymalnego czasu trawienia enzymatycznego (1.4), umieszczenie zacisku hemostatycznego nad otworem dwunastniczym wspólnego przewodu żółciowego (2.2.3), kaniulację wspólnego przewodu żółciowego (2.3), energiczne wstrząsanie trzustki po trawieniu w 37°C (3.2) oraz usunięcie zanieczyszczeń z komórek egzokrynnych (3.3.7 i 3.3.16). Etapy te mają ogromny wpływ na jakość, wydajność i czystość wyizolowanych wysepek. Prawdopodobnie najtrudniejszym technicznie krokiem jest kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego. U wielu myszy wspólny przewód żółciowy może być trudny do zwizualizowania ze względu na otaczającą go powięź. W związku z tym często zdarza się, że próby kaniulacji wspólnego przewodu żółciowego kończą się jedynie przebiciem tkanki powięziowej. W takich przypadkach Liberase zaczyna wypełniać otaczającą tkankę łączną i nie perfunduje trzustki. Jeśli zostanie to zaobserwowane, należy zatrzymać przepływ Liberase i ponownie ustawić igłę tak, aby przebiła ona światło przewodu żółciowego. Dzięki praktyce możliwe jest szybkie zidentyfikowanie optymalnej pozycji igły i przeprowadzenie kaniulacji bez uszkodzenia kruchego przewodu.
2. Transplantacja wysepek
Kluczowymi etapami są indukcja cukrzycy za pomocą STZ (5.1) oraz efektywne wprowadzenie wysepek do kieszonki podtorebkowej (5.3.14-5.3.16). STZ jest naturalnie występującym analogiem glukozy, który wykazuje selektywną toksyczność wobec wydzielających insulinę komórek β wysepek 9. Wyselekcjonowana toksyczność ta występuje jednak w stosunkowo wąskim zakresie stężeń. Świadczy o tym fakt, że wysokie dawki STZ mogą prowadzić do szybkiej (2-3 dni) śmiertelności przy braku hiperglikemii. Dlatego też, przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów na szeroką skalę, należy starannie określić optymalną dawkę STZ dla konkretnej szczepu i wieku używanych myszy. Fizyczne wprowadzenie wysepek do kieszonki podtorebkowej jest również kluczowym krokiem. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, niezbędne jest zminimalizowanie utraty wysepek podczas ich aplikacji. Może ona nastąpić w przypadku wystąpienia defektów lub pęknięć w torebce nerkowej pokrywającej kieszonkę albo gdy wstrzyknięta objętość jest zbyt duża. Uszkodzeń torebki można uniknąć poprzez delikatne i ostrożne manipulowanie oraz użycie gładkiej szklanej sondy do przygotowania kieszonki podtorebkowej. Dodatkowo, objętość wstrzykiwanego roztworu można zminimalizować poprzez dokładne usunięcie nadmiaru cieczy w kroku 5.3.6.3. Jeśli supernatant zostanie usunięty do poziomu osadzonych wysepek, w kieszonce podtorebkowej zazwyczaj znajduje się wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić od 400 do 500 wysepek. Jednakże, jeśli objętość iniekcji jest zbyt duża, istnieje większe prawdopodobieństwo wycieku wysepek z kieszonki podczas procesu transplantacji, co obniża powtarzalność eksperymentu.
W ramach niniejszego protokołu możliwe jest zmodyfikowanie niektórych etapów przy jednoczesnym uzyskaniu satysfakcjonujących wyników. Obejmują one następujące modyfikacje: (a) zastosowanie innego enzymu do trawienia trzustki, (b) inną metodę dostarczania enzymu do trzustki, (c) zastosowanie ciągłego gradientu Ficoll-sód-diatrizoat (FSD) zamiast pojedynczego stopnia gęstości Histopaque 1077 oraz (d) transplantację wysepek w miejsca inne niż podtorebka nerki.
<ol class="lalpha">
	<li>W niniejszym protokole Liberaza jest wykorzystywana do osłabienia kontaktów międzykomórkowych w trzustce. Liberaza to w zasadzie mieszanina wysoce oczyszczonych kolagenaz, które okazały się użyteczne w uwalnianiu wysepek z trzustki. Jednakże mniej oczyszczone kolagenazy są w stanie osiągnąć podobny rezultat. Zatem możliwe jest stosowanie różnych dostępnych komercyjnie preparatów enzymatycznych do trawienia trzustki, o ile warunki trawienia zostaną zoptymalizowane w celu uzyskania wysokiej jakości, wydajności i czystości wysepek.</li>
	<li>Możliwe jest również trawienie trzustki bez perfuzji enzymu przez przewody. Podawanie Liberazy przez wspólny przewód żółciowy pozwala na maksymalne wystawienie powierzchni trzustki na działanie enzymu. Skutkuje to bardziej równomiernym trawieniem trzustki i większym uwalnianiem nienaruszonych wysepek. Można jednak zastosować inne kroki w celu zwiększenia powierzchni kontaktu trzustki z enzymem. Na przykład, do izolacji wysepek można zastosować rozdrobnienie trzustki przed inkubacją w Liberazie lub bezpośrednie wstrzyknięcie Liberazy przez torebkę trzustki. Niemniej jednak żadna inna metoda podawania Liberazy nie jest tak skuteczna, jak perfuzja przez wspólny przewód żółciowy. Dlatego rozdrobnienie lub bezpośrednie wstrzyknięcie należy zarezerwować jako ostateczność, jeśli wspólny przewód żółciowy jest uszkodzony i nie nadaje się do perfuzji.</li>
	<li>Alternatywna metoda oddzielania wysepek od komórek egzokrynnych obejmuje zastosowanie gradientu FSD zamiast Histopaque1077 10. Efektywne oddzielenie wysepek od komórek egzokrynnych w tym protokole wynika częściowo z różnicy gęstości między tymi dwoma typami komórek. Histopaque1077 ma gęstość 1,0771 g/ml w temperaturze 25°C. W tej temperaturze Histopaque jest gęstszy od wysepek, ale mniej gęsty od komórek egzokrynnych. W rezultacie, pod wpływem wirowania, Histopaque1077 powoduje osadzanie się komórek egzokrynnych w formie pelletu, podczas gdy wysepki unoszą się na powierzchnię. W zasadzie w tym kroku można zastosować każdą inną substancję o gęstości umożliwiającej oddzielenie wysepek od komórek egzokrynnych, a gradient FSD jest jedną z takich substancji.</li>
	<li>W odniesieniu do miejsca transplantacji wysepek, torebka nerkowa zastosowana w tym protokole jest jednym z niewielu możliwych miejsc. Choć przestrzeń podtorebkowa nerki jest najczęściej raportowanym miejscem transplantacji u myszy, stwierdzono, że efektywne są również inne miejsca, w tym żyła wrotna wątroby, przestrzeń podsiatkówkowa, jądra, poduszka tłuszczowa najądrza, śledziona, a nawet trzustka 11-14. Każde z tych miejsc ma swoje zalety i wyzwania. Zatem wybór miejsca transplantacji wysepek powinien być podyktowany stawianymi pytaniami badawczymi oraz specyficznymi okolicznościami eksperymentów.</li>
</ol> 
Uważa się, że strategie pozwalające przezwyciężyć ograniczenia związane z transplantacją wysepek trzustkowych znacząco zwiększą ich potencjał terapeutyczny. W związku z tym zastosowanie modelu mysiego, szczegółowo opisanego w niniejszym protokole, stanowi atrakcyjną metodę identyfikacji takich strategii.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Odczynnik</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki 27 G</td><td>Sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton #1702</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 10 cm</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego 6 cm</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne 6-0</td><td>Sprzęt</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczny przewód PE 50</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka jednorazowa 5 ml</td><td>Sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>Sprzęt</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Sito nylonowe 0,1 mm</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Sito druciane 0,419 mm</td><td>Sprzęt</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z łaźnią wodną</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Sprzęt</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Sprzęt</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td>Sprzęt</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sekcyjne</td><td>Sprzęt</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki McPherson-Vannas</td><td>Sprzęt</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona</td><td>Sprzęt</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne</td><td>Sprzęt</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizator do izofluranu</td><td>Sprzęt</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z koszem wahadłowym</td><td>Sprzęt</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>Rotor wahadłowy</td><td>Sprzęt</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Sprzęt</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td> końcówki do nakładania żelu</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki p200</td><td>Sprzęt</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Od czasu pionierskich prac Ballingera i Reckarda, które wykazały, że przeszczepienie wysepek Langerhansa u gryzoni z cukrzycą może znormalizować poziom glukozy we krwi, transplantacja wysepek jest rozważana jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1 1,2. W ostatnim czasie postępy w transplantacji ludzkich wysepek dodatkowo wzmocniły ten pogląd 1,3. Istnieją jednak dwa główne ograniczenia, które sprawiają, że transplantacja wysepek nie jest powszechną rzeczywistością kliniczną: (a) zapotrzebowanie na dużą liczbę wysepek na jednego pacjenta, co drastycznie redukuje liczbę potencjalnych biorców, oraz (b) konieczność intensywnej immunosupresji, która znacząco wpływa na pediatriczną populację pacjentów ze względu na ich podatność na długoterminowe skutki immunosupresji. Strategie pozwalające przezwyciężyć te ograniczenia mają potencjał zwiększenia użyteczności terapeutycznej transplantacji wysepek.
Przeszczepianie wysepek pod torebkę nerki myszy jest powszechnie akceptowanym modelem do badania różnych strategii mających na celu usprawnienie transplantacji wysepek. Eksperyment ten wymaga wyizolowania wysokiej jakości wysepek oraz ich implantacji u biorców z cukrzycą. Obie procedury obejmują kroki chirurgiczne, które można lepiej zaprezentować za pomocą filmu niż tekstu. W niniejszym materiale dokumentujemy szczegółowe etapy tych procedur zarówno w formie wideo, jak i protokołu pisemnego. Omówiliśmy również krótko różne modele transplantacji: syngeniczne, allogeniczne, syngeniczne autoimmunologiczne oraz allogeniczne autoimmunologiczne.

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Od wczesnych, pionierskich prac Ballingera i Reckarda, wykazujących, że transplantacja wysepek Langerhansa u gryzoni z cukrzycą może znormalizować...

Transplantacja wysepek została zaproponowana jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu pierwszego. Istnieją jednak dwa główne ograniczenia, które uniemożliwiają jej powszechne zastosowanie w praktyce klinicznej. Po pierwsze, dla każdego biorcy wymagana jest duża liczba wysepek.Ponieważ wysepki są pozyskiwane od dawców organów, liczba potencjalnych biorców jest bardzo ograniczona. Ponowna transplantacja wymaga dożywotniego leczenia silnymi immunosupresantami, co naraża pacjentów, a w szczególności populację pediatryczną, na ryzyko wystąpienia nowotworów, infekcji oraz niewydolności nerek. Transplantację wysepek pod torebkę nerki myszy przeprowadza się w celu zbadania strategii poprawiających wyniki kliniczne przeszczepiania.Wysepki wyizolowane od zdrowych myszy dawców podzielono na grupy i przygotowano do transplantacji. Następnie wysepki zostają przeszczepione do przestrzeni podtorebkowej nerki. W myszach biorcach z cukrzycą funkcję przeszczepu wysepek ocenia się poprzez monitorowanie poziomu glukozy we krwi, co wykazuje, że około 250 do 350 wysepek przywraca glikemię u myszy biorcy o masie 20 gram w ciągu 24 godzin od transplantacji.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa w odniesieniu do etapów kaniulacji. Kaniulacja wspólnego przewodu żółciowego oraz przeniesienie oczek do przestrzeni podtorebkowej nerki są trudne do opanowania. Kroki te wymagają identyfikacji struktur tkankowych, pewnych rąk oraz zastosowania techniki minimalizującej uszkodzenia tkanek.Uśpioną mysz ułóż w pozycji grzbietowej na ręczniku papierowym pod stereomikroskopem i spryskaj brzuch 70% ethanolem. Za pomocą nożyczek otwórz jamę brzuszną, wykonując nacięcie w kształcie litery V od okolic łonowych w kierunku obu przednich kończyn. Mysz znajduje się pod stereomikroskopem.Ustaw go tak, aby głowa była skierowana w stronę obserwatora. Zlokalizuj wejście wspólnego przewodu żółciowego do dwunastnicy za pomocą kleszczyków hemostatycznych, czyli ujście wspólnego przewodu żółciowego do dwunastnicy. Kleszczyki powinny być ustawione tak, aby po zaciśnięciu biegły dokładnie wzdłuż granicy między trzustnicą a jelitem.Zostaną zaprezentowane dwie metody kaniulacji przewodu żółciowego: metoda wolnej ręki oraz metoda z wykorzystaniem pęsety. Stosując metodę wolnej ręki, odciągnij zacisk hemostatyczny założony na dwunastnicę od głowy myszy w stronę ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy został napięty.W pobliżu wątroby znajduje się zbieżność w przewodzie żółciowym, gdzie łączą się żółć odpływająca z pęcherzyka żółciowego oraz enzymy z wątroby. Przed wprowadzeniem do jelit naciągnij przewód żółciowy, aby odsłonić wnętrze miejsca rozwidlenia w kształcie litery V. Użyj zgiętej igły 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 mL w taki sposób, aby igła przesunęła się przez to rozwidlenie i bezpośrednio kaniulowała dolną część przewodu. Wsuń igłę o kilka milimetrów poza koniec ścięcia, aby zapobiec cofaniu się treści do wątroby i pęcherzyka żółciowego.Po pomyślnym przeprowadzeniu kaniulacji należy przepłukać trzustkę, podając dwa mililitry liazy za pomocą strzykawki. Jako wskaźnik optymalnej kaniulacji należy obserwować powiększenie trzustki nad żołądkiem. Alternatywnie można przeprowadzić kaniulację przewodu żółciowego.Stosując metodę cysty kleszczykowej, odciągnij zacisk hemostatyczny C zaciśnięty na dwunastnicy od strony głowy myszy w kierunku ogona, tak aby wspólny przewód żółciowy stał się napięty. Następnie, używając zgiętej igły 27 G przymocowanej do strzykawki 5 ml, przebij powięź poniżej wspólnego przewodu żółciowego w pobliżu wątroby.Przy pozostawieniu igły w miejscu, użyj jej do oddzielenia powięzi od przewodu. Odłóż kleszczyki hemostatyczne i chwyć pęsetę. Używając jednego ramienia otwartej pęsety, podtrzymaj przewód żółciowy w miejscu, w którym igła oddzieliła powięź, jednocześnie przesuwając przewód i pęsetę do przodu.Wsuń igłę do przewodu, używając pęsety jako punktu podparcia. Prawidłowe przeprowadzenie kaniulacji objawia się równomiernym rozszerzeniem obszaru trzustki nad żołądkiem. Po uprzednim przepłukaniu trzustki usuń kleszczyki hemostatyczne z dwunastnicy.Następnie za pomocą pęsety unieś dwunastnicę i użyj drugiej pęsety, aby oddzielić trzustkę od jelit. Następnie odsuń trzustkę od górnej części żołądka i śledziony. Na koniec wyjmij trzustkę z jamy brzusznej i odetnij ją od pozostałych połączeń powięziowych z jelitem, żołądkiem i śledzioną.Umieść trzustkę w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i pozostaw ją na lodzie. Inkubuj trzustkę w temperaturze 37 °C zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Po inkubacji dodaj do probówek 20 ml pożywki i rozdrób tkankę, energicznie wstrząsając probówkami 40 razy w ciągu 10 sekund.Ten etap jest kluczowy dla optymalnego odzysku fiołków. Wiruj komórki z prędkością 800 obrotów na minutę. Resuspenduj w 15 mililitrach pożywki i skondensuj próbki.Przelej resuspenderowaną zawiesinę przez sito z drutu o oczkach 0,419 mm i przelej ją do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz pierwszą probówkę dodatkowymi 10 ml pożywki zawierającej 10% fetal bovine serum i przelej ją przez sito. Skoncentruj komórki poprzez wirowanie, a następnie resuspenderuj osad w 5 ml OptiPrep 1077 w temperaturze pokojowej. Wymieszaj delikatnie w wirówce typu vortex przez kilka sekund, dodaj kolejne 5 ml OptiPrep, rozprowadzając go po ściankach probówki, aby zmyć osad komórkowy ze ścianek. Powoli nanieś pipetą 10 ml bezsurowiczego RPMI po ściance probówki z prędkością 1 ml na 10 sekund.Powinna być widoczna wyraźna granica faz. Następnie próbki należy wirować w wirówce z ruchomymi koszyczkami w temperaturze 20 °C przy 900 ×g przez 20 minut, z bardzo wolnym przyspieszeniem i bez hamowania po zakończeniu wirowania; wyspy zostaną oddzielone od komórek egzokrynnych za pomocą jednorazowej pipety serologicznej o pojemności 10 mL. Przenieść wyspy z granicy faz medium histo Paque do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.W tym momencie można połączyć kilka probówek, aby usunąć pozostałości wyspecjalizowanych struktur, wypełnić probówki pożywką zawierającą serum i odwirować wyspki, wirując probówki przez dwie minuty przy 800 obrotach na minutę. Następnie ponownie zawiesić wyspki w świeżej pożywce. Powtórzyć ten krok co najmniej dwa razy.Resuspender osad w pięciu mililitrach pożywki. Umieścić nylonowy sitko do komórek o oczkach 0,1 mm dnem do góry na stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Przenieść pipetą resuspensję komórek przez sitko, aby zebrać eyelety.Następnie opłucz probówkę o pojemności 50 ml dodatkowymi sześcioma ml pożywki i przepuść ją przez sitko. Nanieś kroplę 3 ml pożywki na szalkę Petriego o średnicy 10 cm. Odwróć sitko do komórek i zanurz je w kropli pożywki, aby zebrać oczka; za pomocą pipety przepuść dodatkowe 5–7 ml pożywki hodowlanej przez sitko do szalki Petriego.Aby zebrać pozostałe przeźrenice z sita przy użyciu obiektywu 4x, należy pojedynczo pobierać przeźrenice pipetą P 200 i przenosić je do probówki mikroodśrodkowej o pojemności 1,5 mililitra. Te obrazy przedstawiają przeźrenice wyizolowane z 12-tygodniowych myszy C 57 black six. Czystość i jakość przeźrenic można ocenić mikroskopowo po zakończeniu procedury izolacji.Na przykład dwa przedstawione tutaj obrazy ukazują reprezentatywne pole, w którym obecne są zanieczyszczenia w postaci debris oraz komórek egzokrynnych. Podczas wyboru soczewek do eksperymentu należy unikać wybierania komórek egzokrynnych stanowiących zanieczyszczenie oraz soczewek, które wydają się niezdrowe. Soczewki z nekrotycznymi centrami są niezdrowe, co pokazano na tej rycinie wykonanej 24 godziny po izolacji; centra nekrotyczne nie będą widoczne bezpośrednio po izolacji.Występowanie wysepek złuszczających komórki jest nieuniknione; mogą one zostać wykorzystane w transplantacji wysepek, co pokazano w tym 24-godzinnym filmie poklatkowym. Bezpośrednio po izolacji w wielu wysepkach rozwijają się centra nekrotyczne. Centra nekrotyczne te wydają się być usuwane z wysepek pod koniec nagrania podczas ich selekcji.Pogrupuj je w taki sposób, aby w każdej probówce znajdował się równomierny rozkład jakości i rozmiaru przemiżbek. Na przykład każda grupa 15 przemiżbek może zawierać cztery duże, sześć średnich i pięć małych przemiżbek. Umieść probówkę na lodzie; przemiżbek można użyć natychmiast do transplantacji lub dalszej manipulacji.Przed użyciem. Umieść sterylną końcówkę do nakładania żelu w otworze probówki typu microfuge o pojemności 1,5 ml w taki sposób, aby powstało delikatne wygięcie w kształcie litery U w wąskim końcu końcówki. Oba otwory końcówki powinny być skierowane bezpośrednio w górę, poza probówkę typu microfuge.Ostrożnie wyjmij probówkę z oczkami z lodu. Upewnij się, że wszystkie oczka opadły na dno probówki. Za pomocą pipety P 200 delikatnie pobierz oczka z dna probówki, używając minimalnej objętości cieczy, i przenieś je do przygotowanego zakrzywionego końcówki.Po osadzeniu oczek usuń jak największą ilość medium z końcówki, aspirując je przez szeroki otwór końcówki do nakładania żelu zawierającej oczka, używając nowej końcówki do nakładania żelu zamocowanej do pipety P 200. Przymocuj nieścięty koniec rurki do wąskiego otworu końcówki do nakładania żelu zawierającej oczka. Następnie zamocuj końcówkę do pipety P 200 i delikatnie wypchnij oczka do rurki.Następnie połącz niezafazowany koniec rurki PE 50 z igłą strzykawki Hamiltona o objętości 25 µL. Przy wycofanym tłoku naciskaj tłok strzykawki, aż oczka znajdą się w odległości około 0,5 cm od zafazowanego otworu. Odstaw strzykawkę, aby oczka mogły zebrać się w jedną masę w pobliżu zafazowanego otworu rurki podczas przygotowywania nerki do przyjęcia oczek.Przygotuj pole operacyjne, przycinając sierść i szorując skórę Betadyną naprzemiennie z 70% izopropyloalkoholem trzy razy. Rozpocznij procedurę transplantacji oczka, wykonując ucisk palca u stopy, aby potwierdzić znieczulenie u myszy biorcy. Umieść trzpień szklanej rurki bezpośrednio pod myszą i poniżej nerki, prostopadle do rdzenia kręgowego.Następnie należy zlokalizować nerkę przez skórę i rozłożyć sterylną draperię chirurgiczną. Po zlokalizowaniu nerki użyć nożyc McFersona, aby wykonać dwucentymetrowe nacięcie przez skórę bezpośrednio nad nią, prostopadle do rdzenia kręgowego. To nacięcie odsłoni ścianę otrzewnej.Wykonaj nacięcie o długości jednego centymetra w ścianie otrzewnej w tym samym kierunku, co nacięcie warstwy skóry, używając trzonu szklanej rurki jako podpórki; wysuń nerkę przez otwór w otrzewnej, uciskając przylegającą powierzchnię. Zwilż powierzchnię odsłoniętej nerki lodowatym, sterylnym PBS za pomocą nasączonego aplikatora z bawełnianym końcem. Powtarzaj ten krok co kilka minut w razie potrzeby, aby zapobiec wyschnięciu torebki nerki.Używając igły o rozmiarze 27 G, wykonaj nacięcie o długości 0,2 centymetra przez torebkę nerki w poprzek jej powierzchni przedniej. Przesuwając się z lewej strony bocznej w stronę prawej strony bocznej, wprowadź szklaną rurkę kapilarną wyciąganą nad płomieniem. Przesuń ją przez wykonane wcześniej nacięcie w kierunku tylnym wzdłuż bocznej powierzchni grzbietowej nerki.Aby utworzyć kieszeń między torebką a miąższem nerki, przesuń przelotki w przygotowanej strzykawce Hamiltona o pojemności 25 ml do samej krawędzi ściętego otworu elastycznej rurki. Następnie wprowadź rurkę ściętą krawędzią do góry do przestrzeni podtorebkowej. Długa krawędź powinna stykać się z miąższem nerki.Przesuń rurkę do najbardziej tylnego końca torebki. Następnie powoli przenieś oczka z rurki PE 50 do przestrzeni podtorebkowej, naciskając tłok strzykawki. W miarę jak oczka wypełniają przestrzeń, powoli wycofuj elastyczną rurkę, aby zrobić więcej miejsca.Po wyjęciu probówki z woreczka, przesuń szklaną sondę wzdłuż zewnętrznej powierzchni nerki w kierunku od przedniej do tylnej, aby delikatnie wprowadzić oczka do bliższego końca woreczka. Używając pęsety z zakrzywionym ramieniem, unieś wyściółkę otrzewnej przylegającą do otworu wykonanego dla nerki. Następnie użyj aplikatora z bawełnianym końcem nasączonego PBS, aby delikatnie przesunąć nerkę z powrotem do jamy otrzewnej.Zamknij otwór u myszy, nakładając szwy na ścianę otrzewnej i klipsy chirurgiczne na warstwę skóry. Umieść mysz z powrotem w klatce i prowadź obserwację. W celu usprawnienia rekonwalescencji, myszy należy zapewnić wodę z octanem. Wyizolowano wysepki z oczu myszy C. Stosując metody opisane w tym filmie, przeniesiono dawkę leczniczą do allogenicznych myszy C 57 black six. Poziomy glukozy we krwi na czczo monitorowano począwszy od pierwszego dnia po operacji.Odrzut powinien być widoczny około 17. dnia u myszy biorców o masie 20 g, które otrzymały 300 wycinków (eyelets) od dawcy allogenicznego. Powrót do sprawności monitorowano u myszy, które otrzymały 150 lub 300 wycinków od dawców syngenicznych. W tych przeszczepach nie obserwuje się odrzutu, ponieważ wycinki pochodzą od dawców syngenicznych.Dawka podana w formie wysepek mierzy główną funkcję wysepek bezpośrednio po transplantacji. Podczas gdy przy 150 wysepkach zaobserwowano marginalną regenerację, pełna regeneracja wystąpiła po transplantacji 300 wysepek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać odpowiednią wiedzę na temat wykonywania kluczowych kroków niezbędnych do izolacji wysepek mysich i ich transplantacji w przestrzeń podtorebkową nerki.Wraz z praktyką nabędziesz umiejętność szybkiego kaniulowania wspólnego przewodu żółciowego, co jest najtrudniejszym etapem niniejszego protokołu.

a-method-for-murine-islet-isolation-subcapsular-kidney

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Metoda izolację wysp mysich i podskórnej transplantacji nerki

Nasz protokół został opracowany w celu czystego i łatwego wprowadzania wysepek lub komórek pod torebkę nerkową myszy. Komórki są zagęszczane w postaci pelletów w końcowej części cewki używanej do transplantacji komórek pod torebkę nerkową. Prostota tej techniki zmniejsza stres dla komórek oraz myszy.

Transplantacja wysepek trzustkowych do torebki nerki u myszy z cukrzycą

Przeszczepianie nerek u myszy jest procedurą wymagającą technicznie, która w celu odniesienia sukcesu wymaga starannej opieki i leczenia pooperacyjnego.

Procedura transplantacji nerki u myszy

W tym filmie opisujemy procedurę wprowadzania komórek wysp trzustkowych do żyły wrotnej wątroby, a następnie aplikacji pianki żelowej, aby skutecznie zapobiec krwawieniu. Krwawienie pooperacyjne jest częstą przyczyną wysokiej śmiertelności podczas przeszczepu wysp trzustkowych.

Mysi model przeszczepu wysp trzustkowych: chirurgiczna metoda wprowadzania wysp trzustkowych do żyły wrotnej i zapobiegania krwawieniu pooperacyjnemu

Nowe podejście łączące przeszczep wewnątrzgałkowy i mikroskopię konfokalną umożliwia podłużne, nieinwazyjne obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w przeszczepionych tkankach in vivo.  Pokazujemy, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do przedniej komory oka myszy.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Celem tego manuskryptu jest opisanie kroków wymaganych do przeprowadzenia przeszczepu nerki u myszy, zwracając szczególną uwagę na szczegóły zespolenia tętniczego.

Technika przeszczepu nerki u myszy

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Oferujemy prostą i skuteczną metodę przeszczepiania grasicy leczonej 2'-deoksyguanozyną E18.5 do torebki nerkowej nagiej myszy. Metoda ta powinna pomóc w badaniu zarówno funkcji komórek nabłonka grasicy, jak i dojrzewania limfocytów T.

Podtorebkowe przeszczepienie nerki mysiej grasicy embrionalnej leczonej 2'-deoksyguanozyną u nagich myszy

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę izolacji wysp trzustkowych myszy i ich przeszczepu pod torebkę nerki. Technika ta umożliwia badanie strategii poprawy wyników klinicznych transplantacji w leczeniu cukrzycy typu 1.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Przeglądaj więcej filmów