Name: Obrazowanie molekularne tkanek i biofilmów biologicznych pod ciśnieniem atmosferycznym za pomocą spektrometrii mas LAESI (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj technikę LAESI do obrazowania molekularnego tkanek biologicznych i biofilmów pod ciśnieniem atmosferycznym bez konieczności przygotowania próbek. Metoda ta umożliwia bezpośrednią analizę molekularną w warunkach natywnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe tej pracy udzielone przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (National Science Foundation) w ramach grantu nr 0719232, amerykański Departament Energii (DEFG02-01ER15129) oraz firmę Protea Biosciences, Inc. (Morgantown, WV). Autorzy chcieliby również podziękować Jessica A. Stolee za pomoc podczas nagrywania wideo protokołu.

Poniższy protokół opisuje główne etapy eksperymentu z wykorzystaniem laserowej ablacji z jonizacją przez elektrospray (LAESI) oraz przedstawia reprezentatywne przykłady obrazowania bocznego i trójwymiarowego (3D) dla próbek tkanek zwierzęcych i roślinnych. Dodatkowe szczegóły eksperymentalne i techniczne można znaleźć w innych źródłach.1-6
1. Przygotowanie i montaż tkanki
<ol>
 <li>Jeśli wymagane jest cięcie, należy użyć kriomikrotomu do przygotowania skrawków tkanki o grubości 10-100 μm w temperaturze od -10 do -20 °C, chyba że dla danego rodzaju tkanki zalecane są inne warunki.</li>
 <li>Należy zamontować skrawki na płaskiej powierzchni (np. chemicznie oczyszczonym szkiełku przedmiotowym) bezpośrednio, bez użycia modyfikatorów chemicznych. W przypadku tkanek ciętych, skrawki należy montować metodą rozmrażania (thaw-mounting) i niezwłocznie po tym procesie przymocować uchwyt próbki do stolika chłodzącego Peltiera, aby tkanka pozostawała zamrożona przez cały czas trwania analizy. Krok ten jest niezbędny w celu zminimalizowania lub zapobiegania migracji molekularnej w skrawku.</li>
 <li>W razie potrzeby należy zastosować radiator z wentylatorem o niskiej mocy, aby ułatwić odprowadzanie ciepła ze stolika Peltiera i utrzymać tkankę w stanie zamrożonym.</li>
 <li>W wilgotnym środowisku, przy dłuższym czasie ekspozycji (1-2 godziny), należy kontrolować, czy na powierzchni tkanki nie tworzy się kondensat wody lub lód. Kondensacja wody na tkance negatywnie wpływa na jakość obrazowania w eksperymentach LAESI.1</li>
 <li>Jeśli jest to konieczne, należy użyć osuszacza powietrza lub umieścić schłodzoną próbkę w komorze środowiskowej wypełnionej gazem obojętnym (np. suchym azotem), aby zapobiec kondensacji.1</li>
</ol>
2. Optymalizacja źródła jonów LAESI
Źródło jonów LAESI składa się z lasera średniej podczerwieni, szeregu elementów optycznych do kierowania i ogniskowania światła, a także dodatkowych uchwytów na próbki, komponentów chłodzących, stołów translacyjnych oraz systemu podawania rozpuszczalnika. Rycina 1 przedstawia typowy układ tych elementów względem wlotu źródła jonów ciśnieniowych atmosferycznych spektrometru mas.
<ol>
 <li>Zgodnie z ilustracją na Rysunku 1, umieść próbkę 15-20 mm poniżej otworu stożka próbkowania spektrometru mas (dOR-FP).</li>
 <li>Uruchom laser średniej podczerwieni o długości fali 2,94 μm i częstotliwości powtarzania 10 Hz. Osłab moc wyjściową lasera do energii ~100 μJ/impuls.</li>
 <li>Użyj zestawu luster złotych i soczewki skupiającej przezroczystej dla długości fali lasera (np. soczewki plano-konweksowej z CaF2 lub ZnSe), aby wprowadzić energię impulsu laserowego do próbki pod kątem prostym (patrz kąt padania względem powierzchni próbki po prawej stronie na Rysunku 1).</li>
 <li>Ustaw oś wiązki średniej podczerwieni 5-8 mm przed otworem stożka próbkowania spektrometru mas.</li>
 <li>Dostosuj położenie soczewki skupiającej oraz energię impulsu wiązki lasera, aby uzyskać usuwanie tkanki w plamce ogniskowania. Wymiary objętości ablacyjnej określają rozmiar piksela (lub voksela w obrazowaniu trójwymiarowym) dla zastosowań obrazowania.</li>
 <li>Umieść emiter nanospray w linii z osią wlotową spektrometru mas, w odległości ~10 mm od otworu do końcówki emitera (patrz Rysunek 1).</li>
 <li>Do rozpylania elektrostatycznego przygotuj 50% roztwór metanolu z dodatkiem 0,1% kwasu octowego lub 0,1% octanu amonu dla odpowiednio dodatniego lub ujemnego trybu jonów. W zależności od próbki, metanol można zastąpić innymi rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak acetonitryl, izopropanol itp., w stężeniach odpowiednich dla danego zadania analitycznego. Stabilność rozpylania elektrostatycznego jest kluczowa dla pomyślnego obrazowania. W zależności od wyboru rozpuszczalnika, należy dostosować szybkość przepływu i napięcie rozpylania, aby uzyskać stabilny strumień.</li>
 <li>W przypadku reaktywnego LAESI6 w zastosowaniach obrazowania, roztwór rozpylany elektrostatycznie może zawierać substraty.</li>
 <li>Użyj pompy strzykawkowej do podawania roztworu rozpylania elektrostatycznego przez emiter z szybkością przepływu ~300 nL/min.</li>
 <li>Jeśli otwór spektrometru mas jest utrzymywany pod niskim napięciem (&lt;500 V względem masy), wywołaj rozpylanie elektrostatyczne poprzez przyłożenie wysokiego napięcia bezpośrednio do emitera (np. 3000 V) lub poprzez złączkę metalową. W przeciwnym razie uziem bezpośrednio emiter lub złączkę metalową, aby zainicjować rozpylanie elektrostatyczne.</li>
 <li>Uruchom źródło rozpylania elektrostatycznego w trybie cone-jet, aby zapewnić najefektywniejszą generację jonów metodą LAESI. Wpływ zmiennych operacyjnych na tryby rozpylania oraz ich wpływ na widma masowe opisano w innych publikacjach.5,7,8</li>
 <li>Ostrożnie dostosuj wzajemne odległości w układzie LAESI, aby zoptymalizować wydajność jonową LAESI, utrzymując osie wiązki lasera, emitera i otworu w tej samej płaszczyźnie. Szczegółowe instrukcje znajdują się w innych źródłach.5</li>
 <li>Za pomocą mikroskopu optycznego określ wymiary poprzeczne krateru ablacyjnego na próbce.</li>
 <li>W przypadku eksperymentów z trójwymiarowym obrazowaniem LAESI, przeprowadź ablację pojedynczymi impulsami i określ głębokość voksela, wykorzystując na przykład tryb z-stack w mikroskopii optycznej.3</li>
</ol>
3. Obrazowanie molekularne i analiza danych
W eksperymencie obrazowania próbka tkanki jest przemieszczana w płaszczyźnie ogniskowej lasera w kierunkach X i Y z wielkością kroku większą lub równą wymiarom plamki ablacji. Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona przez ogniskowanie padającej wiązki laserowej.
<ol>
 <li>Wybierz obszar zainteresowania na powierzchni próbki i określ współrzędne (X, Y) odpowiadających mu granic.</li>
 <li>Wybierz algorytm siatkowania (np. siatka adaptacyjna, obrazowanie wybranego regionu, siatka prostokątna, wzór spiralny, skanowanie Z itp.), za pomocą którego powierzchnia próbki zostanie przeskanowana rastrowo z wybranym czasem ekspozycji dla każdego piksela w obrazowanym obszarze.</li>
 <li>Użyj trójosiowego stołu translacyjnego oraz oprogramowania zdolnego do rastrowania próbki zgodnie z predetermined siatką.</li>
 <li>Oblicz całkowity czas wymagany do wykonania obrazowania.</li>
 <li>Wyłącz limit czasu akwizycji danych spektrometru mas. Jeśli nie jest to możliwe, ustaw limit czasu akwizycji danych na obliczoną wartość czasu obrazowania.</li>
 <li>Uruchom źródło lasera średniofalowego podczerwieni z częstotliwością repetycji odpowiednią do uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu w widmie masowym w czasie ekspozycji dla każdego piksela podczas eksperymentu obrazowania bocznego LAESI. W przypadku obrazowania molekularnego 3D zastosuj szybkość akwizycji widm wyższą niż częstotliwość repetycji źródła lasera, aby pomyślnie przeprowadzić analizę masową jonów generowanych w obrębie jednego impulsu laserowego. Czekaj na sygnał START w celu zainicjowania sekwencji ablacji.</li>
 <li>Włącz źródło elektrospray. Upewnij się, że znajduje się wystarczająca ilość roztworu na cały czas wymagany do obrazowania.</li>
 <li>Jednocześnie URUCHOM (START) akwizycję widm masowych, ablację laserem średniofalowym IR oraz skanowanie powierzchni.</li>
 <li>Po zakończeniu procesu obrazowania ZATRZYMAJ (STOP) skanowanie powierzchni, działanie lasera średniofalowego IR oraz akwizycję danych.</li>
 <li>Wyłącz źródło lasera.</li>
 <li>Wyłącz wysokie napięcie.</li>
 <li>Wyłącz pompę strzykawkową.</li>
 <li>Ustaw spektrometr mas w tryb czuwania (STANDBY).</li>
 <li>Wyłącz elektronikę chłodzenia Peltiera.</li>
 <li>Zamknij przepływ gazu obojętnego, jeśli był stosowany.</li>
 <li>Użyj oprogramowania do powiązania współrzędnych bezwzględnych pikseli w obrazowaniu bocznym lub wokseli w analizie 3D z odpowiadającymi im widmami.</li>
 <li>Przedstaw sygnał intensywności jonów dla wybranej wartości m/z w funkcji współrzędnych bezwzględnych analizy, aby uzyskać boczne i trójwymiarowe obrazy molekularne.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki dla kilku głównych typów tkanek i modalności obrazowania. Panel A ukazuje przypadek przekroju tkanki zwierzęcej, która została zamrożona podczas eksperymentu w celu zapobieżenia odwodnieniu.1 Dodatkowo próbkę umieszczono w środowisku suchego azotu, aby uniknąć kondensacji pary wodnej z otoczenia na powierzchni próbki. Przekrój czołowy mózgu szczura (Rattus norvegicus) o grubości 100 µm został obrazowany bocznie za pomocą LAESI. Regiony anatomiczne mózgu (patrz obraz optyczny w panelu A) wykazują dobrą korelację z obrazem molekularnym uzyskanym dla plazmalogenów PC(O-33:3) i/lub PE(O-36:3) o m/z 728.559.
Panel B przedstawia obrazowanie 3D LAESI tkanki liścia rośliny Zebra (Aphelandra squarrosa). Ponieważ liście posiadają naturalny mechanizm obronny przed odwodnieniem, próbkę można było badać w warunkach otoczenia.3 Uzyskane trójwymiarowe obrazy molekularne ujawniły różnorodne wzorce rozmieszczenia metabolitów pierwotnych i wtórnych. Wśród nich akacetyna o m/z 285.076 została wykryta przy wyższych liczbach jonów w żółtych sektorach drugiej i trzeciej warstwy od góry, natomiast w pozostałych wykazano rozkład jednorodny. Rozmieszczenie to było zgodne ze wzorem ubarwienia widocznym na obrazie optycznym.
<img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig1.jpg" alt="Schemat układu wzbudzenia optycznego z wykorzystaniem lasera IR do pomiaru absorpcji przejściowej przy 2,94 μm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat systemu LAESI (ES, końcówka emitera elektrospray; OR, otwór stożka pobierającego spektrometru mas; FL, soczewka skupiająca; FP, punkt ogniskowania; P, ogniwo chłodzące Peltiera; HS, radiator). Część materii cząsteczkowej wyrzuconej podczas ablacji w średniej podczerwieni (czerwone kropki) łączy się z elektrosprayem, tworząc naładowane kropelki zaszczepione cząsteczkami i jonami próbki (zielone kropki). Jony uwalniane z tych kropelek są analizowane i rejestrowane przez spektrometr mas.
<img src="/files/ftp_upload/2097/2097fig2.jpg" alt="Obrazowanie spektrometrią mas, m/z 728,559, analiza sekcji tkankowej; 3D mapa mikrostruktury powierzchni rośliny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki obrazowania bocznego i 3D z wykorzystaniem spektrometrii mas LAESI. (A) Górny panel przedstawia obraz optyczny przekroju koronarnego mózgu szczura (Rattus norvegicus) oraz obraz molekularny uzyskany dla plazmalogenów PC(O-33:3) i/lub PE(O-36:3) o m/z 728,559. Biały pasek skali odpowiada 1 mm. Adaptowano za zgodą z (Referencja 1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) Dolny panel pokazuje obrazowanie 3D liścia pantery (Aphelandra squarrosa). Akacetyna o m/z 285,076 została wykryta przy wyższych liczbach jonów w żółtych sektorach drugiej i trzeciej warstwy od góry, przy jednoczesnym jednorodnym rozkładzie w pozostałych. Przedrukowano za zgodą z (Referencja 3). Copyright 2009 American Chemical Society.

<ol><li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Imaging+of+Small+Metabolites+and+Lipids+in+Rat+Brain+Tissues+at+Atmospheric-Pressure+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 82, 982-988 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+electrospray+ionization+for+atmospheric-pressure%2C+in+vivo%2C+and+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+metabolites+in+tissues+under+ambient+conditions+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+molecular+imaging+and+depth+profiling+of+live+tissue+by+infrared+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNemes%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).</li>
<li>Shrestha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+lipids+and+small+metabolites+in+mouse+brain+tissue+by+AP+IR-MALDI+and+reactive+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry.</a> Analyst. 135, 751-758 (2010).</li>
<li>Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spraying+mode+effect+on+droplet+formation+and+ion+chemistry+in+electrosprays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays.</a> Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).</li>
<li>Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+noncovalent+complexation+changes+in+proteins+during+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization.</a> Anal Chem. 80, 387-395 (2008).</li>
<li>Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+by+Mid-IR+laser+ablation+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).</li>
<li>Shrestha, B., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+metabolic+profiling+of+single+cells+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311, 1566-1570 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Różne rodzaje tkanek wykazują zróżnicowaną zawartość wody i wytrzymałość na rozciąganie, co z kolei może wpływać na charakterystykę ablacji próbek.9 Aby zniwelować te efekty, zaleca się modyfikację fluencji laserowej, sposobu manipulacji próbkami oraz protokołów analitycznych przy zmianie głównego rodzaju tkanek.
W przypadku badań pojedynczych komórek lub analiz o wyższej rozdzielczości, światło w średniej podczerwieni można wprowadzić do zaostrzonego światłowodu zamiast przez soczewkę skupiającą.10 Dzięki umieszczeniu końcówki światłowodu w bliskim sąsiedztwie wybranych komórek w tkance, analizę LAESI można przeprowadzić na poziomie pojedynczej komórki.
Jako bezznakowe źródło jonów dla spektrometrii mas z jonizacją w warunkach otoczenia,11 LAESI wykazuje duży potencjał w badaniu procesów biochemicznych w tkankach. Dzięki dodatkowym zaletom, takim jak analiza bezpośrednia oraz obrazowanie boczne i 3D, LAESI staje się rozwijającym się narzędziem bioanalitycznym zarówno w zastosowaniach profilowania, jak i obrazowania.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr mas</td><td>Waters</td><td>Q-TOF Premier</td><td></td></tr><tr><td>Laser w średniej podczerwieni (Mid-IR)</td><td>Opotek Inc. (Carlsbad, CA)</td><td>Vibrant IR</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas laesi

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Metody jonizacji w atmosferze w spektrometrii mas pozwalają na prowadzenie badań analitycznych bezpośrednio na tkance lub biofilmie w warunkach eksperymentalnych zbliżonych do naturalnych. Jonizacja przez rozpylanie elektrosprayowe z ablacji laserowej (LAESI) jest jedną z takich metod i jest szczególnie odpowiednia do badania próbek zawierających wodę. LAESI wykorzystuje wiązkę lasera średniej podczerwieni (długość fali 2,94 μm) do wzbudzenia cząsteczek wody w próbce. Po przekroczeniu progu gęstości energii ablacji materiał próbki jest wyrzucany w postaci cząsteczek, które przemieszczają się na odległość kilkunastu milimetrów powyżej powierzchni próbki. W metodzie LAESI pióropusz ablacyjny ten jest przechwytywany przez silnie naładowane kropelki, aby przechwycić część wyrzuconego materiału próbki i przekształcić jego składniki chemiczne w jony w fazie gazowej. Do analizy i rejestracji składu uwalnianych jonów pochodzących z badanego obszaru (piksela) próbki wykorzystuje się spektrometr mas wyposażony w interfejs źródła jonów pracującego pod ciśnieniem atmosferycznym. Systematyczna analiza układu pikseli umożliwia obrazowanie molekularne w trybie mikroanalizy. Unikalnym aspektem obrazowania spektrometrycznego LAESI jest profilowanie głębokości, które w połączeniu z obrazowaniem bocznym pozwala na trójwymiarowe (3D) obrazowanie molekularne. Przy obecnej rozdzielczości bocznej i głębokości wynoszących odpowiednio ~100 μm i ~40 μm, obrazowanie spektrometryczne LAESI pomaga badać strukturę molekularną tkanek biologicznych. W niniejszym opracowaniu omawiamy główne elementy systemu LAESI i przedstawiamy wytyczne dla udanego eksperymentu obrazowania.

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Metody jonizacji w fazie gazowej (ambient ionization) w spektrometrii mas pozwalają na prowadzenie analiz bezpośrednio na tkance lub biofilmie w warunkach zbliżonych do natywnych...

W celu przeprowadzenia eksperymentu obrazowania spektrometrią mas typu „lazy” na tkance biologicznej lub biofilmie, przygotowuje się układ „lazy” do stabilnej pracy. Kolejnym krokiem jest zamontowanie próbki w uchwycie oraz określenie warunków eksperymentalnych wymaganych dla badanej próbki. Następnie uruchamia się eksperyment lateralnego obrazowania molekularnego typu „lazy”, a uzyskane dane są wykorzystywane do wyznaczenia przestrzennych rozkładów molekularnych.Wyniki obrazują architekturę molekularną tkanek biologicznych i biofilmów. Jestem dr Peter Nemes z Vertus Research Laboratory na George Washington University. Główną zaletą techniki LASE w porównaniu z innymi metodami, w tym konfokalnymi, optycznymi oraz metodami obrazowania spektrometrią mas, takimi jak MALDI i SIMS, jest możliwość przeprowadzenia analizy próbki bezpośrednio na tkance w warunkach ciśnienia atmosferycznego, bez konieczności przygotowania próbki.Przymocuj interesujące przekroje tkanek bezpośrednio do płaskiej powierzchni, takiej jak chemicznie oczyszczone szkiełko przedmiotowe bez modyfikatorów chemicznych. Jeśli jest to konieczne, natychmiast po przymocowaniu zabezpiecz próbkę na chłodzącej platformie Peltiera; użyj radiatora z wentylatorem o niskiej mocy, aby ułatwić odprowadzanie ciepła z platformy Peltiera. Następnie, w przypadku pracy w wilgotnym środowisku przez dłuższy czas, około od jednej do dwóch godzin, sprawdź, czy na powierzchni tkanki nie skropliła się woda lub nie utworzył się lód.Kondensacja wody na tkance negatywnie wpływa na wydajność obrazowania w eksperymentach z wykorzystaniem laserów. W razie potrzeby należy użyć osuszacza powietrza lub umieścić badaną próbkę w komorze środowiskowej wypełnionej gazem obojętnym, takim jak suchy azot, aby zapobiec kondensacji. Po zoptymalizowaniu warunków utrzymania próbki, należy przystąpić do optymalizacji źródła jonów stosowanego podczas ablacji laserowej, jonizacji elektrosprayowej lub laserowego źródła jonów, które składa się z lasera średniej podczerwieni (w skrócie mid-ir) oraz szeregu elementów optycznych służących do kierowania i ogniskowania światła.Układ obejmuje również dodatkowe uchwyty na próbki, elementy chłodzące, stoły translacyjne oraz system elektrosprayu. Część materii cząsteczkowej wydzielonej podczas ablacji w średniej podczerwieni łączy się z elektrosprayem, tworząc naładowane kropelki zawierające cząsteczki i jony próbki. Jony uwalniane z tych kropelek są analizowane i rejestrowane przez spektrometr mas, którego wlot pokazano tutaj.Układ laserowy jest konfigurowany przed rozpoczęciem eksperymentu. Wymagane jest precyzyjne dostrojenie parametrów doświadczalnych, aby dostosować je do wybranej próbki i zoptymalizować źródło jonów. Należy rozpocząć od umieszczenia próbki od 15 do 20 milimetrów poniżej otworu stożka próbkującego spektrometru mas.Uruchomić laser średniej podczerwieni (mid IR) przy długości fali 2,94 µm i częstotliwości repetycji 10 Hz. Osłabić moc wyjściową lasera do poziomu około 100 µJ energii na impuls. Aby wprowadzić energię wiązki laserowej do próbki, zastosować układ zwierciadeł złotych oraz soczewkę skupiającą, która jest przezroczysta dla danej długości fali lasera.Przy prostopadłym kącie padania ustaw oś B średniej podczerwieni w odległości od pięciu do ośmiu milimetrów przed otworem stożka próbkowania spektrometru mas. Dostosuj pozycję soczewki skupiającej oraz energię impulsu laserowego, aby uzyskać usunięcie tkanki w punkcie ogniskowania do pożądanej głębokości. Wymiary objętości ablacyjnej.Określ rozmiar piksela dla zastosowania obrazowania. Umieść emiter nanospray w linii z osią wlotową spektrometru mas, w odległości około 10 mm od otworu wlotowego. Do rozpylania elektrostatycznego przygotuj 50% roztwór metanolu z 0,1% kwasem octowym dla trybu jonów dodatnich lub 0,1% octanu amonu.Dla trybu jonów ujemnych. Stabilność rozpylania elektrosprayowego jest kluczowa dla skutecznego obrazowania. W zależności od wybranego rozpuszczalnika należy dostosować szybkość przepływu oraz napięcie rozpylania, aby uzyskać stabilny strumień rozpylania.W przypadku zastosowań reaktywnych, leniwych oraz obrazowania, roztwór do elektroryzacji może zawierać odczynniki. Należy użyć pompy strzykawkowej, aby podawać roztwór do elektroryzacji przez emiter elektroryzacyjny z szybkością przepływu wynoszącą około 300 nanolitrów na minutę. Jeśli otwór spektrometru mas jest utrzymywany pod niskim napięciem, na przykład poniżej około 500 voltów w stosunku do masy, należy wygenerować elektroryzację poprzez przyłożenie wysokiego napięcia, na przykład 3000 voltów, bezpośrednio do emitera elektroryzacyjnego lub poprzez metalową złączkę.Uruchom źródło elektrorsikowe w trybie natrysku stożkowego (cone jet), aby uzyskać najefektywniejszą generację jonów; ostrożnie dostosuj wzajemne odległości elementów układu, aby zoptymalizować wydajność jonów, utrzymując osie wiązki laserowej, emitera i otworu w tej samej płaszczyźnie za pomocą mikroskopu optycznego. Wyznacz wymiary boczne krateru ablacyjnego na próbce dla eksperymentów trójwymiarowego obrazowania. Przeprowadź ablację za pomocą pojedynczych impulsów i wyznacz głębokość woksela, wykorzystując na przykład tryb Z-stack w mikroskopii optycznej.Po zoptymalizowaniu warunków montażu tkanki oraz źródła jonizacji można przystąpić do obrazowania molekularnego w eksperymencie obrazowania. Próbka tkanki jest przemieszczana w płaszczyźnie ogniskowej lasera w kierunkach x i y z rozmiarem kroku większym lub równym wymiarom plamki ablacyjnej. Rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona przez ogniskowanie padającej wiązki laserowej.Wybierz obszar zainteresowania na powierzchni próbki i określ współrzędne XY odpowiadających mu granic. Wybierz algorytm siatkowania, który pozwoli na rasteryzację powierzchni próbki z wybranym czasem przebywania w każdym pikselu w obrębie obszaru do obrazowania. Użyj trójosiowego stołu przesuwanego XS oraz oprogramowania zdolnego do przesuwania próbki zgodnie z wcześniej określoną siatką.Następnie oblicz całkowity czas wymagany do obrazowania. Uruchom średniofalowe źródło laserowe z częstotliwością repetycji odpowiednią do uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu dla wybranych jonów w widmie mas w czasie przebywania na każdym pikselu. Aby przeprowadzić eksperyment obrazowania bocznego typu „lazy”, włącz źródło rozpylania elektromagnetycznego.Należy upewnić się, że przygotowano wystarczającą ilość roztworu na cały czas wymagany do obrazowania. Następnie należy jednocześnie rozpocząć akwizycję widm mas, ablację laserową w średniej podczerwieni oraz skanowanie powierzchni i zbierać dane. Po zakończeniu procesu obrazowania należy zatrzymać skanowanie powierzchni, laser w średniej podczerwieni oraz akwizycję danych.Wyłącz źródło laserowe, wyłącz wysokie napięcie, wyłącz pompę strzykawkową i ustaw spektrometr mas w tryb czuwania. Wyłącz również elektronikę chłodzącą płytkę oraz zamknij przepływ gazu obojętnego, jeśli był on używany.Na koniec należy nanieść sygnał intensywności jonów dla wybranej wartości MZ w funkcji współrzędnych bezwzględnych analizy, aby uzyskać lateralne lub trójwymiarowe obrazy molekularne. Przedstawione ryciny są reprezentatywnymi obrazami z lateralnego obrazowania lazy przekroju wieńcowego mózgu szczura o grubości 100 µm. Przekrój został zamrożony podczas eksperymentu i przechowywany w środowisku suchego azotu.Regiony anatomiczne mózgu wykazują dobrą korelację z obrazem molekularnym uzyskanym dla dwóch plasmodium o MZ 2 78 0,59. Jest to eksperyment obrazowania molekularnego w 3D z wykorzystaniem tkanki liścia rośliny zebra badanej w środowisku otoczenia wśród innych metabolitów pierwotnych i wtórnych. ASCE o MZ 2 85 0,076 wykryto przy wyższych liczbach jonów w żółtych sektorach drugiej i trzeciej warstwy od góry z jednorodnym rozkładem.W pozostałych przypadkach rozkład ten był zgodny ze wzorcem zmienności widocznym na obrazie optycznym. H Po jego opracowaniu ta metoda utorowała drogę badaczom z zakresu chemii analitycznej i B do badania składu molekularnego oraz organizacji przestrzennej tkanek i biofilmów o znacznym stopniu nawodnienia.Należy pamiętać, że praca z laserem średniej podczerwieni oraz źródłem rozpylania elektrycznego może być niezwykle niebezpieczna. Podczas tej procedury zawsze należy przestrzegać standardowych protokołów bezpieczeństwa pracy z laserami i stosować odpowiednie ekranowanie wszystkich połączeń elektrycznych.

atmospheric-pressure-molecular-imaging-biological-tissues-biofilms

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów za pomocą spektrometrii mas LAESI pod ciśnieniem atmosferycznym

Analiza pojedynczych komórek jest przeprowadzana za pomocą spektrometrii mas w komórkach roślinnych i zwierzęcych pod ciśnieniem atmosferycznym, wykorzystując zaostrzony światłowód do pobierania próbek komórek w celu przeprowadzenia spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylanie wspomaganą ablacją laserową (LAESI).

Bezpośrednia analiza pojedynczych komórek za pomocą spektrometrii mas przy ciśnieniu atmosferycznym

Wtórna spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (SESI-MS) umożliwia detekcję lotnych związków organicznych (LZO) bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące szybkiej (w ciągu kilku minut) charakteryzacji bakteryjnych LZO przy użyciu SESI-MS.

Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

Spektrometria mas z jonizacją metodą desorpcji (DESI-MS) to metoda otoczenia, za pomocą której próbki, w tym tkanki biologiczne, mogą być obrazowane przy minimalnym przygotowaniu próbki. Poprzez rasterowanie próbki poniżej sondy jonizacyjnej, ta technika oparta na rozpylaniu zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną, aby dostrzec interesujące cechy molekularne w obrębie skrawków tkanki.

Obrazowanie tkanek biologicznych metodą spektrometrii mas z desorpcją i jonizacją metodą elektrorozpylania

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Tutaj prezentujemy protokoły do wykonywania zarówno obrazowania tkanek za pomocą spektrometrii mas otoczenia (MSI), jak i analizy MS na żywo (SCMS) in situ przy użyciu pojedynczej sondy, która jest zminiaturyzowanym wielofunkcyjnym urządzeniem do analizy MS.

Zastosowania pojedynczej sondy: obrazowanie spektrometrią mas i analiza pojedynczych komórek w warunkach otoczenia

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje powtarzalną i niezawodną metodę opartego na sublimacji przygotowania tkanki utrwalonej formaliną przeznaczonej do obrazowania spektrometrii mas.

Optymalne przygotowanie próbek utrwalonych formaliną do obrazowania metodą spektrometrii mas wspomaganej desorpcją/jonizacją laserową na bazie peptydów

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Poznaj technikę LAESI do obrazowania molekularnego tkanek biologicznych i biofilmów pod ciśnieniem atmosferycznym bez konieczności przygotowania próbek. Metoda ta umożliwia bezpośrednią analizę molekularną w warunkach natywnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Przeglądaj więcej filmów