Name: Bakteryjne dostarczanie efektorów RNAi: Transkingdom RNAi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę tkRNAi do dostarczania shRNA do komórek nowotworowych za pomocą bakterii E. coli w celu przezwyciężenia wielolekooporności. Ta technika umożliwia skuteczne wyciszanie genów opornościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez grant nr 01GU0615 przyznany przez "Bundesministerium für Forschung und Technologie (BMBF).

1) Bakteryjna dostawa shRNA
<ol>
<li> Przed rozpoczęciem hodowli bakteryjnej należy przygotować podłoże LB oraz agar LB. </li>
<li> W celu przygotowania podłoża LB odważyć ekstrakt drożdżowy (0,5% w/v), trypton bakteryjny (1,0% w/v) oraz NaCl (0,6% w/v), a następnie rozpuścić te składniki w wodzie bidestylowanej. Przygotowane roztwory należy wysterylizować w autoklawie, po czym będą one gotowe do użycia. </li>
<li> W przypadku płytek z agarem LB, przed sterylizacją do podłoża LB należy dodać agar bakteryjny (1,5% w/v). </li>
<li> Podgrzewać agar LB w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia. Pozostawić roztwór do ostygnięcia, aż butelka będzie można go bezpiecznie dotknąć bez ryzyka oparzenia. Dodać kanamycynę (100 mg/ml) w celu selekcji klonów pozytywnych w kolejnych etapach. </li>
<li> Przygotować płytki z agarem LB w komorze z laminarnym przepływem powietrza (warunki sterylne), pipetując 20 ml roztworu agaru LB do 10-cm szalek Petriego. Pozostawić płytki do ostygnięcia, aż ciecz zastygnie. Płytki są teraz gotowe do użycia i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C. </li>
<li> Wektory ekspresyjne kodujące shRNA transformuje się do kompetentnych szczepów E. coli ceq221 metodą szoku termicznego z wykorzystaniem procedury z CaCl2.</li>
<li> Przenosi się transformowane bakterie na płytki z agarem LB zawierającym 100 μg/ml kanamycyny, zamyka pokrywki, uszczelnia płytki parafilmem i inkubuje w pozycji odwróconej w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
<li> Inokuluje się minikultury bakteryjne klonami pozytywnymi, pobierając urośnięte kolonie za pomocą wykałaczki. Wykałaczkę przenosi się do 7,0 ml świeżego podłoża LB zawierającego 100 mg/ml kanamycyny i inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc na wytrząsarce przy 200 rpm.</li>
<li> Inokuluje się 100 ml świeżego podłoża LB zawierającego 100 mg/ml kanamycyny w stosunku 1:100 za pomocą nocnej minikultury w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, a następnie inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc na wytrząsarce przy 200 rpm.</li>
<li> Wysiewa się 25 x 104 (liczba wysiewanych komórek zależy od szybkości wzrostu danej linii komórkowej; konfluencja powinna wynosić ~ 70-80% 24 godziny po wysiewie) ludzkich komórek raka żołądka (EPG85-257RDB) na dołek w naczyniach 6-dołkowych i inkubuje je w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 nasyconej parą wodną przez noc. </li>
<li> Przed infekcją komórek nowotworowych, nocne kultury E. coli zawierające wektor tkRNAi mierzy się fotometrem w celu określenia OD600. Roztwór bakteryjny rozcieńcza się do momentu osiągnięcia gęstości optycznej 0,5 (OD600 = 0,5 odpowiada 1,6 x 108 komórek bakteryjnych/ml). </li>
<li> Na 30 min przed koinkubacją z bakteriami wymienia się pożywkę hodowlaną komórek raka zawierającą FCS na pożywkę bez FCS. </li>
<li> Bakterie przemywa się dwukrotnie 1x PBS i rozcieńcza w bezserowym podłożu Leibovitza L-15.</li>
<li> Dodaje się rozcieńczone bakterie do komórek nowotworowych zgodnie z pożądanym MOI (multiplikacja infekcji = liczba komórek bakteryjnych na jedną komórkę nowotworową) i koinkubuje bakterie z komórkami nowotworowymi przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
<li> Po 2 godzinach koinkubacji komórki nowotworowe przemywa się dwukrotnie 1x PBS oraz raz podłożem Leibovitza L-15 z dodatkiem serum, uzupełnionym o 100 u/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny, 150 μg/ml gentamycyny oraz 100 μg/ml kanamycyny.</li>
<li> Kontynuuje się hodowlę komórek nowotworowych w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2 nasyconej parą wodną.</li>
<li> Efekty traktowania bakteryjnego można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, mierzyć ilościowo za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym na poziomie mRNA oraz za pomocą analizy western blot na poziomie białek, a także wykazać w testach funkcjonalnych, takich jak analiza FACS i testy proliferacji komórek (na życzenie procedury te mogą zostać opisane szczegółowo).</li>
</ol>

2) Reprezentatywne wyniki
Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, wyniki powinny być porównywalne do tych przedstawionych poniżej.

Mikroskopia fluorescencyjna
Rycina 1 przedstawia ludzką komórkę raka żołądka trzy godziny po traktowaniu bakteriami (a) w porównaniu z komórką nietraktowaną (b). W okolicach jądra komórkowego komórki traktowanej można wykryć bakterie.
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig1.jpg" alt="Porównanie w mikroskopii fluorescencyjnej; grupa badana vs kontrolna; analiza morfologii komórek; wynik eksperymentalny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Mikroskopia fluorescencyjna komórki raka żołądka człowieka po traktowaniu bakteriami (1:500) oraz nietraktowanej komórki raka żołądka człowieka jako kontroli, barwienie DAPI, filtr pasmowo-przepustowy DAPI (Λem = 640 nm), obiektyw 40x.

Ilościowa real-time RT-PCR
Na rysunku 2 widoczna jest obniżona regulacja mRNA MDR1 o około 70% (czarny słupek) po zastosowaniu bakterii terapeutycznych. Komórki macierzyste służą jako kontrola pozytywna ze względu na brak nadekspresji MDR1. Linia komórkowa 257RDB p170 zawierająca plazmid wyrażający shRNA przeciwko MDR1 została przyjęta jako bezpośrednie porównanie technologii RNAi transkrólestwowej z innymi strategiami wyciszania RNAi. Jako kontrole pozytywne przyjęto: nieleczoną oporną linię komórkową EPG85-257RDB z nadekspresją MDR1, tę samą linię komórkową leczoną bakteriami pozbawionymi plazmidu wyrażającego shRNA oraz tę linię komórkową leczoną bakteriami terapeutycznymi niosącymi plazmid wyrażający shRNA przeciwko MRP2.
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig2.jpg" alt="Wykres słupkowy poziomów ekspresji mRNA MDR1; przedstawia analizę oporności linii komórkowych, wyniki eksperymentalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilościowa real-time RT PCR ekspresji mRNA MDR1 po leczeniu terapeutycznym E. coli ceq221 wykazującym ekspresję anty-MDR1 shRNA (MOI 1 : 500). Normalizację przeprowadzono z wykorzystaniem genu pomocniczego aldolazy. Stosunek MDR1/aldolaza dla nieleczonych komórek linii EPG85-257RDB przyjęto jako 100 %. Wartości p obliczono za pomocą testu t Studenta (* = p&lt;0,05, ** = p&lt;0,005, *** = p&lt;0,001).
Analiza Western blot
Rysunek 3 pokazuje, że obniżenie poziomu MDR1 nastąpiło również na poziomie białka po zastosowaniu leczenia bakteryjnego. Przedstawiono brak ekspresji MDR1 w wrażliwej na lek linii komórkowej rodzicielskiej (EPG85-257P), ekspresję MDR1 w nieleczonej opornej na leki linii komórkowej (EPG85-257RDB) oraz ekspresję MDR1 w próbce poddanej leczeniu. Można zaobserwować wyraźne obniżenie poziomu MDR1 w komórkach traktowanych bakteriami. <img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig3.jpg" alt="Analiza Western blot; prążki MDR1 i aktyny w liniach komórkowych EP-G85-257; porównanie ekspresji białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3">
Rysunek 3: Analiza Western blot. Poziomy ekspresji MDR1 w nieleczonych komórkach wrażliwych na leki EPG85-257P, nieleczonych komórkach opornych na leki EPG-257RDB oraz w komórkach EPG85-257RDB po wspólnej inkubacji z E. coli ceq221 + p43 MDR1. Przeciwciała pierwszorzędowe C219 1:100 i anty-aktyna 1:5 000, przeciwciało drugorzędowe anty-mysie 1:10 000.
Test cytotoksyczności
Analizy funkcjonalne, takie jak test cytotoksyczności przedstawiony na rysunku 4, stanowią również wskaźniki działania transkrólestwowego RNAi. Linia komórkowa macierzysta oraz linia komórkowa zawierająca plazmidt wyrażający shRNA anty-MDR1 nie wykazują żadnej oporności na daunorubicynę. Oporna linia komórkowa EPG85-257RDB oraz dwie kolejne kontrole nie wykazują istotnych zmian w oporności w porównaniu z próbką traktowaną bakteriami wyrażającymi shRNA anty-MDR1, w której oporność na daunorubicynę została zniesiona o około 90 %.
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący względne wartości IC50 w różnych terapiach bakteryjnych; analiza oporności na antybiotyki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Test cytotoksyczności. Wartości IC50 specyficzne dla leku określone za pomocą testu cytotoksyczności w celu oceny przeżywalności komórek. Wartości p obliczono przy użyciu testu t Studenta (* = p&lt;0.05, ** = p&lt;0.005, *** = p&lt;0.001).

Analiza akumulacji antracyklin
Zgodnie z obniżoną opornością próbek poddanych działaniu bakterii (rycina 4), akumulacja antracyklin w komórkach traktowanych shRNA przeciwko MDR1 wzrosła o około 90%, co przedstawiono na rycini 5. Linia komórkowa macierzysta oraz linia komórkowa 257RDB p170 wykazują silną akumulację daunorubicyny, sięgającą 100%. W wariancie opornym akumulacja występuje rzadko. Komórki traktowane bakteriami wykazującymi ekspresję shRNA przeciwko MDR1 wykazują wzrost akumulacji antracyklin o 90%.
<img src="/files/ftp_upload/2099/2099fig5.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający względną akumulację bakterii w różnych grupach traktowania, z wyróżnieniem efektu MDR1." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza akumulacji antracyklin. Akumulacja antracyklin w komórkach raka mierzona metodą cytometrii przepływowej 6 dni po traktowaniu bakteriami. Wartości p obliczono za pomocą testu t-Studenta (* = p&lt;0,05, ** = p&lt;0,005, *** = p&lt;0,001).

<ol><li>Krühn, A., Wang, A., Fruehauf, J. H., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs+by+transkingdom+RNA+interference+modulates+the+classical+ABCB1-mediated+multidrug-resistant+phenotype+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs by transkingdom RNA interference modulates the classical ABCB1-mediated multidrug-resistant phenotype of cancer cells.</a> Cell Cycle. 8, 3349-3354 (2009).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDR1%2FP-glycoprotein+%28ABCB1%29+as+target+for+RNA+interference-mediated+reversal+of+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance.</a> Curr. Drug Targets. 7, 813-821 (2006).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+cancer+multidrug+resistance%3A+a+still+unsolved+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of cancer multidrug resistance: a still unsolved problem.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 3145-3167 (2008).</li>
<li>Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+RNA+interference+in+drug-resistant+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Fut.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of RNA interference in drug-resistant cancers.</a> Fut. Oncol. 5, 169-185 (2009).</li>
<li>Nguyen, T. A., Fruehauf, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transkingdom+RNA+interference+%28tkRNAi%29%3A+a+novel+method+to+induce+therapeutic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transkingdom RNA interference (tkRNAi): a novel method to induce therapeutic gene silencing.</a> Methods Mol. Biol. 514, 27-34 (2009).</li>
<li>Nieth, C., Priebsch, A., Stege, A., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+classical+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+RNA+interference+%28RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi.</a> FEBS Lett. 545, 144-150 (2003).</li>
<li>Stege, A., Priebsch, A., Nieth, C., Lage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+and+complete+overcoming+of+MDR1%2FP-glycoprotein-mediated+multidrug+resistance+in+human+gastric+carcinoma+cells+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Stable and complete overcoming of MDR1/P-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human gastric carcinoma cells by RNA interference.</a> Cancer Gene Ther. 11, 699-706 (2004).</li>
<li>Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+in+vivo+reversal+of+the+multidrug+resistance+%28MDR%29+phenotype+by+jet-injection+of+anti-MDR1+short+hairpin+RNA-encoding+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Complete in vivo reversal of the multidrug resistance (MDR) phenotype by jet-injection of anti-MDR1 short hairpin RNA-encoding plasmid DNA.</a> Mol. Ther. 16, 178-186 (2008).</li>
<li>Xiang, S., Fruehauf, J., Li, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-expressing+bacteria+elicit+RNA+interference+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.</a> Nat. Biotechnol. 24, 697-702 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Liczba wysiewanych komórek do infekcji oraz odpowiadająca im wartość MOI zależą w znacznym stopniu od obserwowanych linii komórkowych oraz tempa ich wzrostu. Aby ustalić optymalną liczbę komórek do wysiewu, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie eksperymentów wstępnych w celu określenia tempa wzrostu. Ponadto należy przetestować różne wartości MOI ze względu na ograniczoną zdolność komórek do zniesienia inwazji bakteryjnej bez obumarcia z powodu stresu. Optymalny moment czasowy, w którym następuje downregulacja badanego...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Biochrom AG</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Biochrom AG</td><td>A2612</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco buforowany roztwór soli fosforanowej-PBS (10 x)</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>14080048</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; ceq221</td><td>Cequent Pharmaceuticals Inc.</td><td></td><td>Brak dostępnego numeru katalogowego, zamówienie bezpośrednie</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Biochrom AG</td><td>A2710</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen GmbH</td><td></td><td>Zawiera 5,000 jednostek penicyliny (zasada) i 5,000 &amp;mu;g streptomycyny (zasada)/ml z wykorzystaniem penicyliny G (sól sodowa) i siarczanu streptomycyny w 0.85% roztworze soli fizjologicznej.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck KgaA</td><td>1064060500</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Difco Laboratories</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

bakteryjny transport efektorów rnai: transkrólestwowe rnai

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Interferencja RNA (RNAi) stanowi wysoce skutecznym mechanizmem specyficznego hamowania ekspresji mRNA. Poza potencjałem jako potężne narzędzie laboratoryjne, szlak RNAi wydaje się obiecujący w zastosowaniach terapeutycznych. W opracowywaniu terapii opartych na interferencji RNA (RNAi) dostarczanie czynników pośredniczących w RNAi do komórek docelowych jest jedną z głównych przeszkód. Nową strategią pokonania tej bariery jest transkrólestwowa RNAi (tkRNAi). Technologia ta wykorzystuje niepatogenne bakterie, np. Escherichia coli, do produkcji i dostarczania terapeutycznego krótkiego zapętlonego RNA (shRNA) do komórek docelowych w celu wywołania RNAi. Wektor pierwszej generacji pośredniczący w tkRNAi, TRIP, zawiera promotor bakteriofaga T7 służący do regulacji ekspresji interesującego terapeutycznego shRNA. Ponadto TRIP posiada locus Inv z Yersinia pseudotuberculosis, który koduje inwazynę umożliwiającą naturalnym bakteriom nieinwazyjnym wniknięcie do komórek ssaków wykazujących obecność β1-integryny, oraz gen HlyA z Listeria monocytogenes, który produkuje listeriolizynę O. Enzym ten pozwala terapeutycznemu shRNA na ucieczkę z pęcherzyków wejściowych w cytoplazmie komórki docelowej. Konstrukcje TRIP wprowadza się do kompetentnego niepatogennego szczepu Escherichia coli, który koduje polimerazę RNA T7 niezbędną do syntezy shRNA sterowanej przez promotor T7. Dobrze scharakteryzowaną cząsteczką docelową związaną z nowotworami dla różnych strategii RNAi jest ABCB1 (MDR1/P-glikoproteina, MDR1/P-gp). Ten transporter ABC działa jako pompa usuwająca leki i pośredniczy w „klasycznym” fenotypie wielolekowości (MDR) komórek nowotworowych człowieka zależnej od ABCB1, który charakteryzuje się specyficznym wzorcem oporności krzyżowej. Różne komórki nowotworowe MDR wykazujące ekspresję ABCB1 leczono wektorem ekspresyjnym anty-shRNA ABCB1 przenoszonym przez E. coli. Procedura ta doprowadziła do aktywacji szlaków RNAi w komórkach nowotworowych oraz do znacznego obniżenia poziomu mRNA kodującego ABCB1, a także odpowiadającej mu pompy usuwającej leki. W konsekwencji zwiększyła się akumulacja leku w pierwotnie opornych na leki komórkach nowotworowych, a fenotyp MDR został odwrócony. Za pomocą tego modelu dane dostarczyły dowodu koncepcji (proof-of-concept), że tkRNAi nadaje się do modulacji czynników związanych z nowotworami, np. ABCB1, w ludzkich komórkach nowotworowych.

W celu opracowania terapii opartych na interferencji RNA (RNAi) opracowano nową strategię – transkrólestwową interferencję RNA (tkRNAi). Technologia ta wykorzystuje niepatogenne bakterie do produkcji i dostarczania terapeutycznego krótkiego zapinkowego RNA (shRNA) do komórek docelowych. W niniejszej pracy tkRNAi została z powodzeniem zastosowana do odwrócenia klasycznej wielolekowej oporności (MDR) komórek nowotworowych pośredniczonej przez ABCB1.

Bakteryjny transport efektorów RNAi: transkrólestwowe RNAi

Interferencja RNA (RNAi) stanowi wysoce efektywny mechanizm specyficznej inhibicji ekspresji mRNA. Poza potencjałem jako potężne narzędzie laboratoryjne...

W procedurze interferencji RNA (RNAi) typu trans-królestwo, bakterie są wykorzystywane do dostarczania krótkich ryb kasowych RNA (shRNA) lub RNA ukierunkowanego przeciwko badanyemu genowi MDR1 w tym protokole do komórek nowotworowych, w celu wyciszenia badanego genu za pomocą RNAi. Najpierw bakterie Escherichia coli są transformowane wektorem ekspresyjnym shRNA. Następnie wysiewa się komórki nowotworowe Beta 1+, tak aby konfluencja wynosiła 70% do 80% 24 godziny po wysianiu. W kolejnym kroku bakterie ekspresujące shRNA oraz komórki są wspólnie inkubowane przez dwie godziny.Na koniec współinkubację przerywa się poprzez zastosowanie antybiotykoterapii komórek nowotworowych. Wyniki wykazują obniżenie poziomu ekspresji badanego genu na poziomie mRNA, białka oraz funkcjonalnym, co potwierdzono za pomocą real-time PCR, analizy Western blot, testów proliferacji komórek oraz testów akumulacji leku. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi standardowymi procedurami, takimi jak transfekcja siRNA z użyciem oligosów, jest skuteczna i bezpośrednia dostawa irna do komórek docelowych.Technologia Trans Kingdom RNAi, czyli TK RNAi, wykorzystuje niepatogenne szczepy E. coli do produkcji i dostarczania terapeutycznego krótkiego naprzemiennego RNA (shRNA) do komórek docelowych w celu indukcji RNAi. Wektor lub trip pierwszej generacji pośredniczący w TK RNAi zawiera promotor bakteriofaga T7 służący do regulacji ekspresji terapeutycznego shRNA. Ponadto trip zawiera locus INV z Yersinia pseudotuberculosis, który koduje inwazynę, co pozwala naturalnie nieinwazyjnym bakteriom wnikać do komórek ssaków wykazujących ekspresję integryny beta 1.System Tripp zawiera również hli, gen z listeria monocytogenes, który koduje lizynę O listerii. Enzym ten umożliwia terapeutycznemu hRNA wydostanie się z pęcherzyków wejściowych w cytoplazmie komórki docelowej. Konstrukcje Trop są wprowadzane do kompetentnego, niepatogennego szczepu esia coli, który koduje polimerazę RNA T7 niezbędną do syntezy shRNA sterowanej przez promotor T7. Bakterie i komórki eukariotyczne są inkubowane wspólnie, co umożliwia wniknięcie bakterii do komórek eukariotycznych.RNA SH są uwalniane i włączane w ścieżkę RNAi. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować kulturę bakterii E. coli przekształconych wektorem TRIP wykazującym ekspresję S-H-R-N-A w formie hodowli nocnej, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym z dnia poprzedniego. W celu inkubacji bakterii z komórkami docelowymi, należy wysiać 25 × 10⁴ komórek raka żołądka człowieka na każdą studzienkę w płytkach 6-dołkowych.Liczba wysianych komórek zależy od szybkości wzrostu danej linii komórkowej; zaplanuj czas wysiewu tak, aby konfluencja po 24 godzinach wynosiła około 70 do 80%. Po wysianiu inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze nasyconej parą wodną z 5% CO2. Przed rozpoczęciem infekcji komórek nowotworowych zmierz gęstość optyczną nocnych kultur E. coli zawierających wektor TK RNAi.Wyznacz OD 600 i rozcieńcz roztwór bakteryjny do gęstości optycznej 0,5 na 30 minut przed współinkubacją bakterii. W ciągu tych 30 minut zastąp pożywkę hodowli komórek raka zawierającą FCS pożywką wolną od FCS. Przemyj bakterie dwukrotnie 1× PBS poprzez wirowanie przy 4 000 RPM przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie resuspenduj w pożywce wolnej od surowicy.L 15, do pierwotnej objętości rozcieńczenia. Po resuspensji bakterii i zakończeniu 30-minutowej inkubacji komórek, dodać bakterie do komórek nowotworowych z pożądaną wielokrotnością infekcji (multiplicity of infection) lub MRI, która powinna mieścić się w zakresie od 1:300 do 1:700. Inkubować wspólnie bakterie i komórki nowotworowe przez dwie godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze nasyconej parą wodną z dodatkiem 5% CO2.Po dwóch godzinach wspólnej inkubacji przemyj komórki nowotworowe dwukrotnie w 1× PBS, a następnie raz w podłożu L-15 z dodatkiem surowicy zawierającej Penicylinę 100 j./ml oraz Streptomycynę 2,5 µg/ml.Amfoterycyna 150 µg/mL, gentamycyna 100 µg/mL oraz kanamycyna. Hodowlę komórek nowotworowych kontynuowano w temperaturze 37 °C w atmosferze nasyconej parą wodną z dodatkiem 5% CO2. Efekty traktowania bakteriami można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zmierzyć ilościowo za pomocą qRT-PCR na poziomie mRNA oraz zbadać za pomocą analizy western blot.Można również zastosować testy funkcjonalne, takie jak analiza FACS oraz testy proliferacji komórek. To reprezentatywne zdjęcie wykonano trzy godziny po inkubacji komórek raka żołądka człowieka z bakteriami wykazującymi właściwości terapeutyczne. Bakterie S-H-R-N-A można wykryć wokół jądra potraktowanej komórki.W niniejszym eksperymencie za pomocą reakcji realtime PCR zbadano obniżenie ekspresji genu MDR1 odpowiedzialnego za wielolekowość. Po zastosowaniu bakterii terapeutycznych zaobserwowano spadek poziomu mRNA mdr1 o około 70%. Obniżenie poziomu MDR1 po terapii bakteryjnej wystąpiło również na poziomie białka.Poziomy białka MDR one malały w czasie w porównaniu z linią komórkową kontrolną. Analiza funkcjonalna oparta na wynikach przedstawionego tutaj testu cytotoksyczności może służyć jako wskaźnik działania trans-królestwowego RNAi, podczas gdy linia komórkowa oporna na leki nie reaguje na lek przeciwnowotworowy. Poniżej, ta sama linia komórkowa zakażona bakteriami przekształconymi plazmidem ekspresyjnym anty-MDR one S-H-R-N-A wykazuje wrażliwość na lek.Ostatecznie, w teście akumulacji antracyklin, linia komórkowa oporna na nowotwory wykazała niewielką akumulację leku przeciwnowotworowego, co zaobserwowano w komórkach opornych na nowotwory traktowanych MDR one SHRA. Po opanowaniu tej techniki można ją zastosować w ciągu 28 godzin, jeśli jest ona prawidłowo wykonywana zgodnie z niniejszą procedurą. W celu udzielenia odpowiedzi na kilka pytań, takich jak efekty regulacyjne w obrębie badanego genu, można zastosować inne techniki, np. RT-PCR.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat sposobu stosowania trans-królestwowego RNA interferonowego poprzez wspólną inkubację bakterii wykazujących ekspresję hRNA z odpowiednimi komórkami ssaków.

bacterial-delivery-of-rnai-effectors-transkingdom-rnai

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bakteryjne dostarczanie efektorów RNAi: Transkrólestwowe RNAi

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Opisujemy metodę obniżania ekspresji genów w rosnącej populacji komórek E. coli za pomocą ukierunkowanych sekwencyjnie kaset ekspresji sRNA dostarczanych przez wektor fagowy M13.

Dostarczanie za pośrednictwem fagów ukierunkowanych konstruktów sRNA w celu obniżenia ekspresji genów u E. coli

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

System rekombinacji za pośrednictwem λ-czerwieni został użyty do stworzenia mutanta delecji małego niekodującego RNA micC.

Niekodujący mały RNA MicC przyczynia się do zjadliwości białek błony zewnętrznej w Salmonella enteritidis

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.

Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)

W tym filmie przedstawiamy procedurę dokładnego dostarczania reagentów do żywej tkanki metodą biolistyczną przy użyciu nowoczesnej miniaturowej wyrzutni genów. Przeprowadzamy wyciszenie ekspresji cząsteczki Netrin, odpowiedzialnej za prowadzenie aksonów, w embrionach pijawek poprzez dostarczenie cząsteczek dsRNA do brzusznej ściany ciała i zwojów pojedynczych segmentów.

Lokalne RNAi i ektopowa ekspresja genów u pijawki lekarskiej

Poznaj metodę tkRNAi do dostarczania shRNA do komórek nowotworowych za pomocą bakterii E. coli w celu przezwyciężenia wielolekooporności. Ta technika umożliwia skuteczne wyciszanie genów opornościowych.

Bakteryjny transport efektorów RNAi: transkrólestwowe RNAi

Przeglądaj więcej filmów