Name: Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii przyżyciowej do pomiaru mikrokrążenia w mięśniach szkieletowych. Technika umożliwia ciągłą obserwację przepływu krwi na poziomie naczyń włosowatych u żywych zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy JW Lichtmanowi za porady dotyczące obserwacji mięśni in vivo.

Barwienie błony RBC
<ol>
<li>Erytrocyty mysie pobrano od myszy tego samego szczepu z zastosowaniem heparynyzacji.</li>
<li>Erytrocyty mysie barwiono barwnikiem PKH26 (551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit, Sigma, U.S.A.).</li>
<li>Erytrocyty przemyto w PBS i inkubowano z 2μM roztworem barwnika PKH26 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano poprzez dodanie osocza (wcześniej inaktywowanego termicznie przez 1 godzinę w 65°C) i inkubowano przez 1 minutę.</li>
<li>Zbarwione erytrocyty przemyto 5 razy w PBS.</li>
</ol>
Przygotowanie myszy
<ol>
<li>W badaniu wykorzystano samce myszy szczepu C57BL/10 w wieku od trzech do sześciu miesięcy. Myszy znieczulono poprzez dożylne wstrzyknięcie pentobarbitalu (50mg/kgBW).</li>
<li>Następnie myszy intubowano rurką polietylenową o rozmiarze 20-gage, podłączono do wentylatora mechanicznego i ogrzewano w temperaturze 37°C na grzejniku z folii Kapton połączonym z czujnikiem termopary i systemem regulatora temperatury z pętlą sprzężenia zwrotnego.</li>
<li>Ogolono brzuszna stronę szyi. Obnażono prawe i lewe mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe. Mięśnie unieruchomiono w uchwycie ze stali nierdzewnej i poddano superfuzji sterylnym roztworem Krebsa-Ringera.</li>
</ol>
Wstrzyknięcie
<ol>
<li>Barwione erytrocyty ogrzano do 37°C, a następnie rozcieńczono w roztworze Krebsa-Ringera. 50µL barwionych erytrocytów (hematokryt 12%) wstrzyknięto myszy przez żyłę prącia.</li>
</ol>
Mikroskopowa obserwacja mięśni szkieletowych in vivo
Zastosowaliśmy metodę Jeffa W. Lichtmana z wprowadzonymi modyfikacjami1:
<ol>
<li>Zwierzęta umieszczono na podgrzewaczu na ręcznie wykonanym żelaznym stoliku mikroskopu Nikon Eclipse-800. Do obserwacji epi-fluorescencyjnych na żywo wykorzystano obiektywy zanurzeniowe. Obserwowano przepływ RBC barwionych PKH26 wewnątrz naczyń pod światłem fluorescencyjnym lampy rtęciowej. Tętniczki pierwszorzędowe, tętniczki drugorzędowe, kapilary i żyły zidentyfikowano na podstawie kierunku przepływu RBC oraz ich architektury.</li>
<li>Zainstalowano wzmocnioną kamerę SIT (Hamamatsu Photonics, C2400, Japonia) oraz moduł przechwytywania klatek wideo w celu rejestracji słabego sygnału w czasie rzeczywistym z prędkością 30 klatek na sekundę. Obrazy zapisano na płytach DVD w formie plików wideo.</li>
</ol>
Stymulacja mięśni
<ol>
<li>Impuls elektryczny generowano za pomocą stymulatora nerwów obwodowych (Innervator 252, Fisher &amp; Paykel Healthcare, Nowa Zelandia) i przekazywano na powierzchnię mięśnia za pomocą powlekanej sondy ze stali nierdzewnej. Ujemny koniec sondy umieszczono w części proksymalnej mięśnia, a koniec dodatni w części dystalnej mięśnia. Stymulację tężcową stosowano z częstotliwością 50Hz przez 5 sekund. Bodźce elektryczne nie spowodowały bezpośredniego uszkodzenia włókien mięśniowych w obrębie obszaru kontaktu.</li>
</ol>
Analiza przepływu RBC
<ol>
<li>Zarejestrowane obrazy wideo z DVD przeniesiono do plików obrazów Video Savant za pomocą oprogramowania do przechwytywania klatek (Video Savant, USA). Obrazy wideo przeglądano z dostosowaną prędkością w celu wizualizacji poszczególnych barwionych RBC. Strumień RBC mierzono, licząc liczbę RBC przepływających przez skupioną arteriolę pierwszego rzędu w ciągu minuty.</li>
</ol>

<ol><li>Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neuromuscular+junctions+over+periods+of+several+months+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice.</a> J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).</li>
</ol>

Wszystkie procedury związane z doświadczeniami na zwierzętach zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (Subcommittee on Research Animal Care) w Massachusetts General Hospital.

Kluczowe punkty techniczne są następujące: (1) utrzymanie stanu fizjologicznego zwierzęcia (wentylacja, pH roztworu perfuzyjnego, temperatura ciała), (2) objętość wstrzykniętych barwionych RBC oraz (3) warunki obserwacji (optymalny dobór obiektywu, intensywność fluorescencji). Potencjalne przyszłe zastosowania obejmują: (a) połączenie z interwencjami farmakofizjologicznymi i/lub biologii molekularnej, (b) długoterminową obserwację arterio-/arteriolosklerozy oraz neowaskularyzacji.

<table><tbody><tr><td>barwnik PKH26</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>551/567 nm; Zestaw do znakowania komórek czerwonym fluorescencyjnym łącznikiem</td></tr><tr><td>myszy C57BL/10</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>Samce w wieku od trzech do sześciu miesięcy</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td></td><td></td><td></td><td>środek znieczulający, 50mg/kgBW, i.p.</td></tr></tbody></table>

pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

WSTĘP: Czynniki regulacyjne i szczegółowa fizjologia mikrokrążenia in vivo nie zostały w pełni wyjaśnione, mimo opracowania wielu różnych metod obrazowania. Choć wiele makroskopowych parametrów przepływu krwi odzwierciedla prędkość przepływu, to w obserwacjach mikroskopowych zmiany prędkości przepływu krwi i strumienia erytrocytów (RBC) nie wykazują liniowej zależności. Istnieją doniesienia o rozbieżnościach między prędkością a strumieniem RBC, między strumieniem RBC a objętością przepływu osocza, a także o przestrzennej i czasowej heterogeniczności regulacji przepływu w tkankach obwodowych w obserwacjach mikroskopowych, co stanowi naukową podstawę dla konieczności przeprowadzenia bardziej szczegółowych badań nad regulacją mikrokrążenia z wykorzystaniem mikroskopii intravitalnej.METODY: Zmodyfikowaliśmy metodę Jeffa Lichtmana dotyczącą mikroskopowej obserwacji in vivo mięśni mostkowo-obojczykowo-sutkowych myszy. Myszy poddaje się znieczuleniu, wentylacji oraz wstrzykuje im RBC znakowane fluorescencyjnie PKH26L w celu przeprowadzenia obserwacji mikroskopowej.WYNIKI I WNIOSKI: Erytrocyty znakowane fluorescencyjnie są dobrze wykrywane i rozróżniane za pomocą mikroskopu szerokopolowego. Skurcz mięśnia wywołany stymulacją elektryczną doprowadził do zwiększenia przepływu erytrocytów. Możliwa była kwantyfikacja innych parametrów, w tym prędkości erytrocytów oraz gęstości naczyń kapilarnych. Myszy dobrze zniosły zabieg chirurgiczny, wstrzyknięcie znakowanych erytrocytów, obserwację mikroskopową oraz stymulację elektryczną. Nie zaobserwowano uszkodzeń mięśni ani naczyń krwionośnych, co sugeruje, że nasza metoda jest stosunkowo mniej inwazyjna i odpowiednia do długoterminowych obserwacji.

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

WSTĘP: Czynniki regulacyjne oraz szczegółowa fizjologia mikrokrążenia in vivo nie zostały w pełni wyjaśnione mimo zastosowania wielu różnych metod...

Witajcie, nazywam się Aki i jestem pracownikiem naukowym w Harvard Medical School w Massachusetts General Hospital. W tym filmie zaprezentuję nową metodę mikroskopii in vivo. Dzięki tej technice możemy dokonać ilościowego pomiaru przepływu krwi w mikrokrążeniu.Celem naszego eksperymentu jest opracowanie systemu do ciągłego pomiaru mikrosekrecji in vivo. Projekt ten został zaprojektowany w celu wizualizacji przepływu krwi na poziomie naczyń kapilarnych w mięśniach przedramienia żywego zwierzęcia pod mikroskopem. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami pomiaru jonów in vivo, takimi jak ultrasonografia krwi czy pomiar napięcia tlenowego, nasza metoda umożliwi pomiar wielu parametrów przepływu krwi, mianowicie strumienia erytrocytów lub prędkości ich przepływu oraz przepływu plazmy. Pomiar tych parametrów pozwoli na dokładniejsze ujawnienie zmian w mikrokrążeniu.Następnie nasza metoda została zastosowana do wykrywania zmian przepływu krwi w odpowiedzi na stymulację fizjologiczną w żywych tkankach mięśniowych. Nasza metoda jest prostsza i mniej inwazyjna niż konwencjonalna mikroskopia in vivo, dzięki czemu mięśnie są bezpośrednio dostępne, co pozwala nam na zastosowanie elektrycznej st

in-vivo-micro-circulation-measurement-skeletal-muscle-intra-vital

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

W tym artykule przedstawiamy metodę analizy mikronaczyń guza in vivo za pomocą dynamicznej wideomikroskopii fluorescencyjnej wzmocnionej kontrastem. Uzyskano dwa parametry ilościowe: funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych odzwierciedlającą unaczynienie guza oraz nieszczelność wskaźnika odzwierciedlającą nieszczelność ściany śródbłonka.

In vivo (in vivo) Obrazowanie angiogenezy guza za pomocą fluorescencyjnej wideomikroskopii konfokalnej

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Ta metoda opisuje użycie Kwantowej Mikrotomografii Komputerowej (MicroCT) do oceny morfologii, funkcji, perfuzji, metabolizmu i żywotności serca za pomocą jodowego środka kontrastowego u myszy z eksperymentalnie wywołanym niedokrwieniem mięśnia sercowego. Technika ta może być stosowana do nieniszczącego, wysokoprzepustowego, podłużnego obrazowania in vivo różnych zwierzęcych modeli chorób ludzkiego serca.

In vivo (in vivo) Ilościowa ocena struktury, funkcji, perfuzji i żywotności mięśnia sercowego za pomocą mikrotomografii komputerowej serca

Wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych reguluje perfuzję mięśni i zwiększa powierzchnię mikrokrążenia (rekrutację mikronaczyniową) dostępną do wymiany substancji rozpuszczonej między krwią a śródmiąższem tkankowym. Przedstawiono połączoną mikroskopię przyżyciową i ultrasonografię ze wzmocnieniem kontrastowym w celu jednoczesnej oceny działania insuliny na większe naczynia i mikrokrążenie in vivo.

Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną

Systemy videomikroskopii służą do badania funkcjonalnych właściwości izolowanych tętniczek tkanki tłuszczowej w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne. Technika ta może być stosowana do badania fenotypów mikronaczyniowych w różnych domenach tkanki tłuszczowej u otyłych ludzi.

Ocena funkcji mikrokrążenia tkanki tłuszczowej człowieka za pomocą wideomikroskopii

Tutaj opisujemy proste, nieinwazyjne podejście wykorzystujące spektroskopię bliskiej podczerwieni do oceny reaktywnego przekrwienia, sprzężenia nerwowo-naczyniowego i zdolności oksydacyjnej mięśni szkieletowych podczas jednej wizyty klinicznej lub laboratoryjnej.

Sprzężenie nerwowo-naczyniowe mięśni szkieletowych, zdolność oksydacyjna i funkcja mikrokrążenia dzięki spektroskopii bliskiej podczerwieni "One Stop Shop"

Obecny protokół opisuje zwięzłe szczegóły eksperymentalne dotyczące oceny i interpretacji danych in vivo dotyczących momentu obrotowego uzyskanych za pomocą elektrycznej stymulacji wspólnego nerwu strzałkowego u znieczulonych świń.

In vivo (in vivo) Pomiar izometrycznego momentu obrotowego zginacza grzbietowego kończyny tylnej od świni

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Poznaj metodę mikroskopii przyżyciowej do pomiaru mikrokrążenia w mięśniach szkieletowych. Technika umożliwia ciągłą obserwację przepływu krwi na poziomie naczyń włosowatych u żywych zwierząt.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Przeglądaj więcej filmów