Name: W macicy Elektroporacja, a następnie pierwotna hodowla neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj elektroporację in utero i hodowlę pierwotnych neuronów szczura do badania funkcji genów w podzbiorach komórek korowych. Ta metoda pozwala analizować wpływ manipulacji genetycznej na rozwój neuritów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Josephowi LoTurco i Dennisowi Selkoe za pomocne dyskusje na temat tej techniki. Autorzy dziękują darczyńcom American Health Assistance Foundation za wsparcie tych badań.

Podstawowy protokół elektroporacji in utero został szczegółowo opisany w innym artykule JoVE z laboratorium Kriegsteina 1, 2. Technika ta została pierwotnie opisana w laboratorium Osumiego 3, a nasz protokół opiera się na metodzie opracowanej w laboratorium LoTurco 4. Przedstawimy przegląd naszego protokołu elektroporacji in utero embrionów szczura, koncentrując się na najważniejszych szczegółach, a następnie opiszemy nasz protokół wykorzystujący elektroporację in utero do badania funkcji genów w obrastaniu wypustek neuronalnych.
1. Elektroporacja in utero
<ol>
<li>Przygotowanie DNA i ładowanie igieł 
Pierwszym krokiem w elektroporacji in utero jest zaplanowanie eksperymentu w celu ustalenia, jakie konstrukty DNA mają zostać wstrzyknięte. Metoda ta jest przydatna zarówno do nadekspresji, jak i wyciszania interesujących genów. W przypadku planowania nadekspresji lub błędnej ekspresji genu należy upewnić się, że stosowany promotor jest aktywny w neuronalnych komórkach prekursorowych. Zalecamy promotor CAGGS, który składa się z promotora beta-aktyny kurczaka oraz enhancera CMV 5. Ponieważ za pomocą elektroporacji in utero transfekowana jest tylko niewielka podgrupa komórek, kluczowe jest uwzględnienie plazmidu kodującego białko fluorescencyjne, takie jak GFP, aby umożliwić śledzenie komórek, które zostały pomyślnie elektroporowane. Dla plazmidu kodującego GFP zalecamy przygotowanie DNA w stężeniu 0,5 μg na mikrolitr. W przypadku konstruktów shRNA ustaliliśmy, że stężenie 0,5-1,0 μg/μL pozwala na efektywne wyciszenie interesującego genu. Do nadekspresji lub błędnej ekspresji stosujemy od 1,0 do 3,0 μg na mikrolitr, w zależności od wielkości genu i poziomu ekspresji wymaganego w eksperymencie. DNA jest przygotowywane przy użyciu zestawu do izolacji wolnej od endotoksyn firmy Qiagen i rozcieńczane w 1 x PBS. Wstrzykujemy około 0,5-1,0 μL na embrionalny mózg, zatem dla jednego miotu zwierząt przygotowujemy 10 μL mieszaniny DNA do iniekcji. Do DNA dodajemy 1 μL barwnika Fast Green, aby móc śledzić wstrzyknięte DNA. 
Wytworzenie igieł o odpowiednim kształcie jest krytycznym etapem. Walantus et al. stosuje inny system dostarczania DNA, dlatego przygotowanie igieł w ich metodzie nieco różni się od naszej1,2. Ustawienia używane do wyciągania igieł zależą od marki posiadanej wyciągarki. My korzystamy z modelu 750 firmy David Kopf. Stosujemy następujące ustawienia: Heat 1: 9.0, Heat 2: 0, Solenoid: 0, Filament size 3.0 mm, Heater Proximity: 3 mm, Time: 10 sec. Po wyciągnięciu igły ucinamy je żyletką pod kątem ~45 stopni w taki sposób, aby odległość od najszerszej części otworu do czubka wynosiła 11 mm. Następnie ładujemy DNA od tylnego końca igły. Pozostałą przestrzeń w igle wypełniamy olejem kukurydzianym. Do iniekcji DNA używamy urządzenia Picospritzer III. W zależności od dokładnego skosu uciętego w każdej igle, ustawiamy Picospritzer w zakresie od 4.0 do 6.0. Do dostarczenia sprężonego powietrza, które wypycha DNA z igły, używamy pedału nożnego.</li>
<li> Przygotowanie zwierząt do zabiegu 
Do tych zabiegów używamy wyłącznie wolnych od patogenów szczurów Sprague Dawley. Wiele innych laboratoriów wykorzystuje również myszy o różnych genotypach. Poniżej opisujemy nasz protokół elektroporacji embrionów szczura w dniu E15, jednak elektroporacja in utero jest rutynowo przeprowadzana u szczurów między dniami E13 a E18. Podczas gdy elektroporacja we wczesnym stadium celuje w głębokie warstwy kory, elektroporacje w późniejszym stadium celują w warstwy bardziej powierzchowne. 
Przed rozpoczęciem zabiegu zwierzęta otrzymują przedoperacyjną dawkę buprenorfiny (0,05-0,1 mg/kg). Istnieje kilka opcji znieczulenia zwierzęcia. Walantus et al. stosuje inhalację izofluranem, natomiast my rutynowo stosujemy dostrzykiewną iniekcję ketaminy (40-80 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg)1,2. Zawsze należy wykonać ucisk palca u nogi, aby upewnić się, że zwierzęta są w pełni znieczulone i nie reagują na bodźce. Przez cały czas trwania procedury chirurgicznej zwierzęta znajdują się na podgrzewanej macie. 
Sierść zwierzęcia w okolicy nacięcia zostaje ogolona, a następnie obszar ten jest przemywany trzykrotnie etanolem, a następnie trzykrotnie jodyną. Nacięcie skóry wykonuje się tuż bocznie od linii środkowej, a następnie wykonuje nacięcie w mięśniu. Rogi macicy są bardzo ostrożnie odsłaniane. Są one delikatnie wysuwane z jamy ciała za pomocą opuszków palców. Należy utrzymywać embriony w nawilżeniu za pomocą sterylnego PBS podczas ich przebywania poza jamą ciała.</li>
<li>Wstrzykiwanie DNA i elektroporacja 
Na początku wykonywania tych zabiegów najtrudniejszą częścią jest zapoznanie się z miejscem wstrzykiwania DNA, aby wypełnić komory boczne, oraz przyzwyczajenie się do głębokości wprowadzania igły w celu trafienia w odpowiedni obszar. Embriony są delikatnie manipulowane opuszkami palców, aby zidentyfikować położenie głowy; przy uważnym przyjrzeniu się można dostrzec szew środkowy. Służy on jako ogólny punkt orientacyjny do określenia położenia komory bocznej. DNA wstrzykujemy przez ścianę macicy do komory bocznej. Do sterowania iniekcją DNA używamy pedału nożnego – wykonuje się kilka impulsów wstrzykiwania, aż komora boczna zostanie wypełniona mieszaniną DNA i barwnika. Następnie umieszczamy elektrody płytkowe po obu stronach głowy embrionu i używamy drugiego pedału nożnego, aby dostarczyć impuls elektryczny przez głowę embrionu. Umiejscowienie elektrod jest kluczowe dla określenia, który obszar kory zostanie poddany elektroporacji. Ponieważ DNA jest naładowane ujemnie, podczas przepływu ładunku przez elektrody przemieści się ono w stronę elektrody dodatniej. W zależności od dokładnego rozmieszczenia elektrod, celowane będą różne podgrupy komórek. Rutynowo umieszczamy elektrodę dodatnią w pozycjach grzbietowo-przyśrodkowych przez mózgowie. Jednak laboratorium LoTurco w przejrzysty sposób wykazało, że umieszczenie elektrod w bardziej brzuszno-bocznych regionach mózgowia pozwala na celowanie w komórki granicy kora-prążkowie oraz trafienie w komórki bocznego strumienia korowego 6. Każdy embrion może zostać poddany elektroporacji i w każdym z nich można zastosować różne kombinacje konstruktów DNA.</li>
<li>Szycie i opieka pooperacyjna 
Po elektroporacji wszystkich embrionów rogi macicy są ostrożnie zawracane do jamy ciała, a następnie zszywa się warstwę mięśniową i skórę. Technika ta jest opisana w pracy Walantus et al1,2. Stan zwierząt jest stale monitorowany do czasu wybudzenia z narkozy, a lek przeciwbólowy buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) jest podawany co 8-12 godzin.</li>
</ol>
2. Hodowla elektroporowanych neuronów korowych
<ol>
<li>Pozyskiwanie elektroporowanych mózgów i wycinanie obszarów poddanych elektroporacji 
W przypadku analiz in vivo po elektroporacji in utero, zwierzęta można pobrać w dowolnym punkcie czasowym, od 24 godzin po elektroporacji, w okresie wczesnym po narodzinach, aż do wieku dorosłego. Jednak w celu hodowli pierwotnych neuronów pobieramy tkanki 24 godziny po elektroporacji w dniu E16. W tym czasie elektroporowane embriony wykazują wykrywalne poziomy GFP. 
Zwierzęta są uśmiercane poprzez inhalację dwutlenkiem węgla i szybką dekapitację. Embriony są wycinane z macicy i umieszczane w HBSS z kationami dwuwartościowymi, przy jednoczesnym monitorowaniu, które embriony zostały elektroporowane konkretnymi plazmidami DNA. Kluczowe jest stosowanie filtrowanego HBSS, sterylnych probówek i płytek oraz autoklawowanych narzędzi do sekcji. Kora mózgu jest wycinana, a opona mózgowa usuwana przy użyciu mikroskopu w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Kore zostaną następnie zaobserwowane pod mikroskopem stereoskopowym z możliwością wizualizacji GFP. Identyfikuje się obszary kory dodatnie pod kątem GFP, a następnie za pomocą nożyczek typu vanna wycina się te obszary z kory. Fragmenty te są umieszczane w HBSS bez kationów dwuwartościowych w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
<li>Dysocjacja i wysiew neuronów 
Po wycięciu wszystkich obszarów dodatnich pod kątem GFP, HBSS zastępuje się 0,25% trypsyną i inkubuje w temperaturze 37°C przez 5 minut. Trypsynę usuwa się, zastępując ją pożywką do wysiewu (DMEM + 5% FBS + Penn/strep + glutamina), a następnie przeprowadza tryturację 5-7 razy w celu dysocjacji komórek. Stosowane objętości zależą od ilości obecnej tkanki. Zdysocjowane komórki są następnie wysiewane na szkiełka z komorami pokryte CC2. Na dwa szkiełka z komorami wysiewamy 200 000-350 000 komórek na komorę w objętości 1,5 mL pożywki do wysiewu. Po 4 godzinach pożywkę do wysiewu odsysa się i zastępuje 1,5 mL pożywki do hodowli neuronów (pożywka Neurobasal + dodatek B27 + glutamax + gentamycyna) na komorę.</li>
</ol>
3. Analiza wypustek neuronalnych
<ol>
<li>Fiksacja i immunobarwienie kultur 
W celu pomiaru krótkotrwałych efektów manipulacji genetycznej tych komórek, zbieramy pierwotne neurony po trzech dniach in vitro. Jeśli pierwotne neurony mają być hodowane dłużej w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz, połowę pożywki należy wymieniać co trzy dni. Aby sfiksować kultury, odsysamy pożywkę z komór i utrwalamy neurony w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut. Po fiksacji komórki są płukane dwukrotnie w PBS, a następnie umieszczane w roztworze blokującym (2% surowica osła z 0,1% Triton X-100 w PBS) na jedną godzinę. Następnie komórki inkubuje się z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1 godzinę. Do analiz wzrostu wypustek neuronalnych używamy przeciwciała anty-beta tubulinie w celu identyfikacji neuronów – immunobarwienie beta II tubuliny znakuje ciało komórki neuronalnej, dendryty i aksony. Komórki są następnie płukane trzykrotnie w PBS przez pięć minut, a potem inkubowane z Cy3-anty-mysie przez 1 godzinę, po czym następuje kolejne trzy płukania w PBS, przeciwbarwienie jąder DAPI i montowanie preparatów.</li>
<li>Pomiar długości neurytów 
Obrazy neuronów wykazujących pozytywną ekspresję GFP i beta-III tubuliny są pozyskiwane przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioskop z systemem kamer MC100. W tych komórkach GFP-dodatnich można zbadać kilka zmiennych, w tym długość wszystkich neurytów, długość najdłuższego neurytu, rozgałęzienia neurytów, rozmiar somy komórkowej itp. Metodę tę wykorzystaliśmy do analizy wzrostu wypustek neuronalnych po wyciszeniu lub nadekspresji genów związanych z neurorozwojem i neurodegeneracją, koncentrując się na długości wypustek neuronalnych. W celu pomiaru wzrostu wypustek neuronalnych używamy oprogramowania Axiovision LE 4.4 (firmy Zeiss). W oprogramowaniu tym dostępna jest opcja wyboru narzędzia „outline”. Korzystając z tego narzędzia, można za pomocą myszy komputerowej obrysować długość każdej wypustki neuronalnej. Kluczowe jest zdefiniowanie używanego obiektywu, aby uzyskać dokładny pomiar neurytów. Do tych analiz zazwyczaj używamy obiektywu 20x.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Stwierdziliśmy, że wielkość miotu szczurów Sprague Dawley mieści się w przedziale od 6 do 14 embrionów. Zazwyczaj przeprowadzamy elektroporację wszystkich embrionów. Każdy embrion może zostać poddany elektroporacji z innym zestawem kwasów DNA. Zazwyczaj jednak elektroporujemy co najmniej cztery mózgi w tym samym wariancie, a następnie łączymy je przed dysocjacją i wysiewaniem.
Stwierdziliśmy, że przy zastosowaniu tej techniki około 75% elektroporowanych mózgów jest ukierunkowanych na pożądaną część kory, niezależnie od tego, czy jest to kora grzbietowo-przyśrodkowa, czy brzuszno-boczna (Rycina 1). Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że wczesne elektroporacje w dniach E13-14 celują w neurony głębokich warstw, takie jak neurony warstwy VI dodatnie pod kątem Tbr1, podczas gdy późniejsze elektroporacje celują w komórki warstwy V dodatnie pod kątem CTIP2 i ujemne pod kątem TBR1, a jeszcze późniejsze w komórki warstwy II/III dodatnie pod kątem Brn2. Doskonały opis różnych markerów oraz wyjaśnienie specyfikacji podtypów neuronalnych w korze znajduje się w artykule Moleneaux i wsp. 7. Rycina 2 przedstawia przekroje czołowe mózgów elektroporowanych w dniu embrionalnym 15,5 lub 17,5 i pobranych w 5. dniu postnatalnym. Kolorem czerwonym zaznaczono barwienie immunohistorochemiczne Oct6. Można przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne markerów w hodowli, aby potwierdzić, w jakie populacje warstw komórkowych celowano. Stwierdziliśmy, że można oczekiwać ukierunkowania na tę samą populację warstwy komórkowej w każdym embrionie z tego samego miotu (innymi słowy, celowanie zależy od punktu czasowego rozwoju embrionalnego, a nie od innych zmiennych technicznych).
W hodowli odsetek komórek wykazujących ekspresję GFP może być bardzo zróżnicowany, w zależności od tego, jak ostrożnie wycinany jest obszar z dodatnim sygnałem GFP (Rysunek 3). Jednakże, nawet przy bardzo zachowawczym podejściu i wycinaniu wyłącznie fragmentu komórek z dodatnim sygnałem GFP, najwyższy obserwowany odsetek wynosi 5-10% – mimo wycinania obszaru kory, który został poddany elektroporacji, celowane są komórki tylko w jednej warstwie. Ta niska wydajność transfekcji jest pomocna w identyfikacji tego, które wypustki należą do analizowanej, elektroporowanej komórki. Wysięwanie komórek z taką wyższą gęstością przyczynia się do uzyskania zdrowszych kultur, jednak utrudnia rozróżnienie, która wypustka należy do którego ciała komórkowego w przypadku komórek z ujemnym sygnałem GFP (Rysunek 3).
Jeśli mają Państwo trudności z dostrzeżeniem wszystkich drobnych wypustek elektroporowanych komórek, można zwiększyć stężenie DNA GFP używanego do elektroporacji w celu zwiększenia ekspresji GFP lub przeprowadzić immunobarwienie rozdzielonych komórek przy użyciu przeciwciała anty-GFP (firmy Invitrogen) oraz przeciwciała wtórnego Cy2.
<img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przekrojów mózgu wykazujące ekspresję genu z użyciem zielonego białka fluorescencyjnego." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Szczury Sprague-Dawley w dniu E15.5 poddano elektroporacji plazmidem GFP, a materiał pobrano trzy dni później. W zależności od rozmieszczenia elektrod celowane będą różne obszary kory. Panele A-F przedstawiają fluorescencję GFP w całych mózgach.
<img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Wyniki mikroskopii; elektroporacja w dniach E15,5 i E17,5, ekspresja białek fluorescencyjnych w komórkach nerwowych." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Szczury Sprague-Dawley w dniach E15,5 (A) lub E17,5 (B) poddano elektroporacji plazmidem GFP i pobrano w 5. dniu po urodzeniu. Mózgi utrwalono, pocięto w płaszczyźnie czołowej przy użyciu wibrotomu (przekroje 100 micron), a następnie poddano immunobarwieniu na Oct6 (kolor czerwony). Panele A i B przedstawiają obrazy konfokalne immunobarwionych przekrojów.
<img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Analiza sieci neuronalnej; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące połączenia neuronów i pomiary." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Szczury Sprague-Dawley w stadium E15.5 poddano elektroporacji plazmidem GFP. 24 godziny po elektroporacji pobrano mózgi, a następnie wypreparowano i dysocjowano obszary elektroporowane, dodatnie pod kątem GFP, zgodnie z opisem w filmie. Po 3 dniach in vitro komórki utrwalono i poddano immunobarwieniu na bIII-tubulinę (czerwony) oraz barwieniu jąder DAPI (niebieski) (A,C). Długość najdłuższego neurytu zmierzono przy użyciu oprogramowania Axiovision (B,D).

<ol><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li>
<li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li>
<li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li>
<li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

In vitro badanie pierwotnych kultur neuronalnych pozwala na ilościową analizę wzrostu neurytów. Aby zbadać, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na wzrost wypustek neuronalnych, konstrukty shRNA lub konstrukty do nadekspresji można wprowadzić do pierwotnych neuronów poprzez transfekcję chemiczną lub transdukcję wirusową. Jednak w przypadku pierwotnych komórek korowych metodami tymi transfekowana jest heterogenna pula typów komórek (neurony glutaminergiczne z różnych warstw, neurony hamujące, komórki glejowe)...

<table><tbody><tr><td>10X roztwór Hanksa&amp;rsquo; Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; bezpłatny</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>10X roztwór Hanksa&amp;rsquo; Zrównoważony roztwór soli (HBSS) (z Ca)&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; )</td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES pH 7,4</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petri 100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petri 60 x 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>probówka stożkowa 15 ml</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-547-205</td><td></td></tr><tr><td>probówka stożkowa 50 ml</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-554-205</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki </td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe pęsety</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta precyzyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki sprężynowe Vannasa </td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyny-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr Reichert Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny licznik impulsów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z169021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>pożywka NEUROBASAL </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suplement bezsurowiczy B-27 </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX -I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór odczynnika z gentamycyną </td><td>GIBCO, firmy Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>roztwór soli fosforanowo-buforowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko beta-III tubulinie</td><td>Chemicon International</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko MAP2</td><td>Chemicon International</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysi przeciwciało osiołkowe Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-166-151</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało osiołkowe anty-kurze Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-226-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Powlekane szkiełka dwukomorowe CC2 </td><td>Lab-Tek</td><td>154852</td><td></td></tr><tr><td>Media montażowe do fluorescencji</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>VWR international</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>elektroporator BTX z falą prostokątną</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTXECM830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrody, 7 mm, platynowe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450488</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro badanie pierwotnych kultur neuronalnych umożliwia ilościową analizę wzrostu neurytów. W celu zbadania, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na wzrost wypustek neuronalnych, do pierwotnych neuronów można wprowadzić konstrukty shRNA lub cDNA za pomocą transfekcji chemicznej lub transdukcji wirusowej. Jednak w przypadku pierwotnych komórek kory za pomocą tych metod transfekowana jest heterogeniczna populacja typów komórek (neurony glutaminergiczne z różnych warstw, neurony hamujące, komórki glejowe). Zastosowanie elektroporacji in utero w celu wprowadzenia konstruktów DNA do kory zarodka gryzonia pozwala na ukierunkowanie działań na określone podgrupy komórek: o ile elektroporacja wczesnej kory zarodkowej obejmuje głębokie warstwy kory, o tyle elektroporacja w późniejszych etapach rozwoju zarodkowego obejmuje warstwy bardziej powierzchowne. Ponadto zróżnicowane rozmieszczenie elektrod na głowach poszczególnych zarodków umożliwia ukierunkowanie na obszary grzbietowo-przyśrodkowe w przeciwieństwie do obszarów brzuszno-bocznych kory. Po elektroporacji transfekowane komórki mogą zostać wyizolowane, dysocjowane i wysiane in vitro do ilościowej analizy wzrostu neurytów. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółową metodę ilościowego pomiaru wzrostu wypustek neuronalnych w podgrupach komórek kory.
Podstawowy protokół elektroporacji in utero został szczegółowo opisany w dwóch innych artykułach JoVE z laboratorium Kriegsteina 1, 2. Przedstawimy przegląd naszego protokołu elektroporacji in utero, koncentrując się na najważniejszych szczegółach, a następnie opiszemy nasz protokół wykorzystujący elektroporację in utero do badania funkcji genów w obrastaniu wypustek neuronalnych.

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Badania in vitro na pierwotnych kulturach neuronów umożliwiają ilościową analizę wzrostu neurytów. Aby zbadać, w jaki sposób zmiany genetyczne wpływają na...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie efektów rozwojowych wynikających z knockdownu lub nadekspresji genów w specyficznych podzbiorach neuronalnych komórek progenitorowych w neocortex. Jest to osiągane poprzez elektroporację DNA in vivo w embrionach szczura w celu transfekcji neocorticalnych komórek progenitorowych. W drugim kroku obszar poddany elektroporacji jest wycinany, aby wzbogacić populację o komórki przetransfekowane.Następnie komórki te są dysocjowane, wysiewane na szkiełka komorowe i hodowane. W celu zbadania wpływu zarówno wewnątrzkomórkowych zmian genetycznych, jak i zastosowania czynników egzogennych, uzyskano wyniki wykazujące wpływ na wzrost i rozgałęzianie się neurytów na podstawie pomiarów ilościowych z wykorzystaniem oprogramowania avision. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi, takimi jak transfekcja kultur pierwotnych neuronów z użyciem lipidów, jest możliwość celowania w konkretne podgrupy komórek progenitorowych neuronów.Na przykład za pomocą tej metody zostaną przetransfekowane wyłącznie neurony glutaminergiczne. Ponadto możemy przeprowadzić elektrospray na wcześniejszych etapach embrionalnych, aby celować w neurony głębszych warstw

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In utero Elektroporacja, a następnie hodowla pierwotnych neuronów w celu badania funkcji genu w podzbiorze korowych neuronów

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Poznaj elektroporację in utero i hodowlę pierwotnych neuronów szczura do badania funkcji genów w podzbiorach komórek korowych. Ta metoda pozwala analizować wpływ manipulacji genetycznej na rozwój neuritów.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

Przeglądaj więcej filmów