W macicy Elektroporacja, a następnie pierwotna hodowla neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych
8 października 2010
Elektroporacja in utero jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod i punktu czasowego rozwoju elektroporacji, pewne podzbiory komórek korowych mogą być celowane. Docelowe komórki mogą być następnie analizowane in vivo lub in vitro pod kątem skutków zmian genetycznych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie skutków rozwojowych knockdownu lub nadekspresji genów w określonych podzbiorach neuronalnych komórek progenitorowych w korze nowej. Osiąga się to poprzez elektroporację in vivo DNA w zarodkach szczurów w celu transfekcji komórek progenitorowych kory nowej. W drugim etapie elektroporowany obszar jest preparowany w celu wzbogacenia dla transfekowanych komórek.
Następnie komórki te są dysocjowane i platerowane w szkiełkach komorowych i hodowane. W celu zbadania wpływu zarówno wewnętrznych zmian genetycznych, jak i zastosowania czynników egzogennych, uzyskano wyniki, które pokazują wpływ na wzrost i rozgałęzianie neurytów w oparciu o pomiary ilościowe za pomocą oprogramowania avision. Główną przewagą tej techniki nad innymi, takimi jak transfekcja pierwotnych kultur neuronalnych na podstawie lipidów, jest to, że możemy celować w określone podzbiory neuronalnych komórek progenitorowych.
Na przykład tylko neurony glutaminergiczne będą transfekowane tą metodą. Ponadto, możemy modlić się elektrolitycznie we wcześniejszych stadiach embrionalnych i celować w wcześnie urodzone neurony głębszej warstwy, lub możemy elektrolitować na późniejszych etapach rozwoju i celować w później urodzone neurony, które są przeznaczone dla bardziej powierzchownych warstw kory mózgowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurorozwoju.
Na przykład, w jaki sposób czynniki wewnętrzne i zewnętrzne oddziałują na siebie, wpływając na rozrost i rozgałęzianie się neuronów? Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozrost procesów neuronalnych, może być również stosowana do innych procesów neurorozwojowych, takich jak synaptogeneza, proliferacja komórek i oznaczanie siarczanów. Przygotować igłę do wstrzykiwań zgodnie z opisem w dołączonym tekście.
Unikanie pęcherzyków wypełnij igłę DNA wyrażającym GFP, a interesujący nas gen obejmuje szybki zielony Aby uwidocznić zastrzyki, załaduj pozostałą przestrzeń w igle olejem kukurydzianym. Podłączyć spryskiwacz pico do załadowanej igły, aby kontrolować wstrzyknięcia. Odsłoń rogi macicy znieczulonej ciężarnej szczura w sprayu, jak opisano wcześniej.
A w tekście dołączonym do tego filmu jest pokazane tutaj iniekcja zarodków E 15. Zidentyfikuj miejsce wstrzyknięcia, oświetlając zarodki lampą na gęsiej szyi. Delikatnie manipuluj jednym zarodkiem, aby znaleźć miejsce, w którym znajduje się głowa i zlokalizować szew w linii środkowej.
Użyj tego jako punktu orientacyjnego, aby znaleźć komorę boczną. Wstrzyknij DNA przez ścianę macicy i do komory bocznej. Wstrzyknij wiele impulsów do komory, aż zostanie ona wypełniona DNA.
Wektor wyznaczony przez rozmieszczenie elektrod ma kluczowe znaczenie dla określenia, który obszar kory nowej jest elektroporowany. Tutaj elektroda dodatnia jest umieszczana w pobliżu grzbietowych pozycji przyśrodkowych w poprzek mózgu, aby celować w ten obszar przodomózgowia. Naprzemienne rozmieszczenie elektrod będzie ukierunkowane na inne obszary kory mózgowej, w tym boczny strumień korowy.
Wstrzyknij i poddaj elektropostacji każdy zarodek. Z kolei rogi macicy należy przywrócić do jamy ciała i zamknąć nacięcie. Monitoruj zwierzęta, gdy dochodzą do siebie po znieczuleniu.
Tutaj zwierzęta są zbierane do hodowli 24 godziny po elektroporacji, aby GFP było wykrywalne. Usuń zarodki z macicy szczura poddanego eutanazji i umieść je na szalce Petriego wypełnionej lodowatym HBSS z dwuwartościowym kationem w okapie przepływowym blaszki. A pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy numer pięć Dumonta.
Aby wypreparować korę. Użyj kleszczy dumont rozmiar trzy, aby usunąć opony mózgowe, włącz fluorescencję za pomocą nożyczek val. Wytnij obszary tkanki z dodatnim wynikiem GFP.
Przenieś te kawałki do 50-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej lodowatym HBSS bez kationu dwuwartościowego. Zbierz wszystkie dodatnie kawałki GFP w probówce. Wyjmij HBSS z probówki i zastąp go jednym mililitrem 0,25% roztworu EDTA wymieszanego delikatnie w inkubatorze inwersyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Usuń roztwór tripsin. Zastąp go od jednego do pięciu mililitrów pożywki galwanicznej, w zależności od ilości tkanki dodatniej GFP. Używając dwumililitrowej pipety paskowej, zjadłem od pięciu do siedmiu razy, aby rozdzielić komórki.
Policz komórki za pomocą cytometru hemocytometrycznego rozcieńczonego pożywką galwaniczną do stężenia od dwóch do 3,5 razy 10 do pięciu komórek na 1,5 mililitra płytki pożywki 1,5 mililitra w każdej komorze dwupowłokowej komory CC. Zjeżdżalnia. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby komórki przylgnęły do szkiełek. Aspirat pożywki galwacyjnej zawierała 1,5 mililitra pożywki neuronalnej na kulturę komorową.
Komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza do pożądanego etapu przed przystąpieniem do barwienia immunologicznego. Do pomiarów procesów neuronalnych. Czas wzrostu kultury waha się od 24 godzin do siedmiu dni.
W dygestorium odessać pożywkę z każdej komory hodowlanej. Napraw komórki 4% formaldehydem przez 15 minut. Przemyć szybko dwa razy jednym raz PBS przed zablokowaniem i odpornością widoczną w kulturach, jak wyszczególniono w załączonym tekście, zamontować kultury za pomocą fluorescencyjnego podłoża mocującego i szkiełka nakrywkowego.
Wizualizuj kultury pod 20 razy pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rejestruj obrazy neuronów GFP dodatnich do analizy. Odkryliśmy, że dzięki tej technice około 75% mózgów poddanych elektroporacji jest ukierunkowanych na pożądany obszar kory, niezależnie od tego, czy jest to grzbietowa kora przyśrodkowa, czy brzuszna kora boczna.
Znaleźliśmy wczesną elektroporację w E 13 do 14 docelowych neuronów głębokiej warstwy, takich jak TBR, jedna dodatnia warstwa sześciu neuronów, podczas gdy późniejsza elektroporacja docelowa CT IP dwa dodatnie TBR jedna ujemna warstwa pięć komórek, jeszcze późniejsza elektroporacja docelowa BRN dwie dodatnie warstwy dwie ukośne trzy komórki. Tutaj pokazujemy koronalne sekcje mózgu poddane elektroporacji w 15,5 lub 17,5 dniu embrionalnym i pobrane w piątym dniu po urodzeniu. W hodowli procent komórek, które są dodatnie dla GFP, może się znacznie różnić w zależności od tego, jak konserwatywny jesteś podczas preparowania regionu GFP dodatniego.
Jednak nawet jeśli jesteśmy bardzo konserwatywni i analizujemy tylko dodatni płat komórek GFP, najwyższy odsetek, który obserwujemy, wynosi od pięciu do 10%Ta niska wydajność transfekcji jest pomocna w określeniu, które procesy należą do elektroporowanego ogniwa, które analizujesz. Posiewanie komórek o tej większej gęstości przyczynia się do uzyskania zdrowszych kultur. Trudno jest jednak określić, który proces należy do którego ciała komórkowego w komórkach ujemnych GFP.
Po tej procedurze można przeprowadzić barwienie immunologiczne dla kilku różnych markerów, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące proliferacji, synaptogenezy i oznaczania siarczanów. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu sterylnych odczynników i narzędzi, aby zapobiec zakażeniu i infekcji po opanowaniu. Każdy aspekt tej techniki można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Więc to wszystko. Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada efekty rozwojowe manipulacji genami w określonych podzbiorach komórek progenitorowych neuronów za pomocą elektroporacji in utero. Poprzez nakłucie tych komórek w zarodkach szczurów, naukowcy mogą analizować wpływ zmian genetycznych na rozwój neuronów.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Inżynieria genetyczna
Tło
- Elektroporacja in utero pozwala na ukierunkowane nawracanie komórek progenitorowych neuronów.
- Technika ta umożliwia badanie funkcji genów in vivo.
- Określone podzbiory komórek kory mózgowej mogą być analizowane w oparciu o czas i miejsce elektroporacji.
- Zrozumienie wpływu genetyki na rozwój neuronów jest kluczowe dla poznania zaburzeń neurorozwojowych.
Cel badania
- Zbadanie efektów knockdownu genów lub ich nadmiernej ekspresji w neokortyksowych komórkach progenitorowych.
- Ocena wpływu zmian genetycznych na wzrost i rozgałęziania się neurитów.
- Wykorzystanie technik in vivo w celu zwiększenia swoistości badań genetycznych w rozwoju neuronów.
Zastosowane metody
- In vivo elektroporacji DNA do zarodka szczura.
- Rozebranie elektroporowanego regionu w celu wzbogacenia komórek nawracanych.
- Dysocjację i hodowlę nawracanych komórek na przegródkach hodowlanych.
- Ilościowe pomiary wzrostu i rozgałęziania się neurитów za pomocą oprogramowania do obrazowania.
Główne wyniki
- Wykazano ukierunkowane nawracanie określonych komórek progenitorowych neuronów.
- Pokazano znaczące efekty manipulacji genetycznej na rozwój neurитów.
- Uzyskano ilościowe dane wspierające zalety elektroporacji in vivo w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
- Podkreślono potencjał badań czynników wewnętrznych i zewnętrznych wpływających na wzrost neuronów.
Konkluzje
- Elektroporacja in utero jest skuteczną metodą badania funkcji genów w rozwoju neuronów.
- Podejście to umożliwia ukierunkowane analizy określonych populacji komórek w neokorteksie.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia genetycznej podstawy procesów neurorozwojowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables targeted genetic manipulation of specific neuronal progenitor cell subsets, addressing a key challenge in neuroscience drug discovery: achieving cellular specificity to de-risk target validation. By isolating defined cortical neuron populations, it supports mechanistic de-risking and improves predictive confidence in early-stage target hypothesis testing. The approach enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation by providing quantitative, reproducible readouts of neurite outgrowth and branching.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in defined glutamatergic or GABAergic neuronal subsets, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by isolating transfection to specific cortical layers or regions, improving target confidence.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking genetic alterations to quantifiable neurite outgrowth phenotypes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified, transfected neuronal cultures suitable for quantitative imaging-based screening of compound effects on neurite morphology.
- Reproducibility: Enables standardized preparation of disease-relevant neuronal systems with consistent transfection efficiency and regional specificity.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple gene targets and developmental timepoints for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cortical neuron development relevant to neurodevelopmental disorders, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges in vivo genetic manipulation with in vitro functional assays, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Allows study of intrinsic and extrinsic factor interactions on neuronal outgrowth, improving predictive confidence in target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling early target validation through subcellular resolution of genetic effects in primary neuronal cultures derived from electroporated embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating genetic effects to specific neuronal progenitor subsets.
- Screening: Provides assay-ready cultures with quantitative neurite outgrowth readouts for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of neurite length and branching via imaging software, enabling objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects embryonic cortical targeting to postnatal phenotypic analysis, supporting continuity in neurodevelopmental disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for targeting diverse cortical neuron populations across multiple genes and developmental stages.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target validation in defined neuronal populations, reduction of mechanistic ambiguity in pathway analysis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of transfected neuronal cultures for consistent assay performance.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, cell-type-specific functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, in utero electroporation, and primary neuronal culture techniques.
- Dependent on instrumentation for embryo injection, electroporator with precise electrode placement, and fluorescent microscopy for tissue validation.
- Necessitates cross-team standardization between animal surgery, cell culture, and imaging analysis groups for reproducible results.
- Involves adaptation considerations across rodent strains, embryonic timepoints, and electrode configurations to target different cortical regions.
- Practical limitations include variable transfection efficiency (5–10% GFP+ cells) and the need for conservative dissection to isolate transfected cells, as supported by source material.
